高效发掘和鉴定版纳微型猪近交系雄性不育关键基因

Banna mini-pig inbred line (BMI) is generally considered to be the ideal biomedical laboratory animals and excellent donor animals in pig-to-human xenotransplantation. However, preliminary study found that there are multiple substrains dying out because of some male individuals being infertile in nearly 35 years of continuous highly inbreding. To solve this problem, this study is to compare the differentially expressed genes and differentially methylated regions between infertile and normal BMI boars from the same environment and age by analyzing their reproductive organs---testes and epididymis using high-throughput transcriptome and genome-wide DNA methylation sequencing, combined with the existing BMI genome-wide re-sequencing results and pig genome database in NCBI. Afterwards, we will comprehensively analyze to identify the key inbred male sterile genes and build network of the functional genes affecting the spermatogenic disorder. Finally, in order to clarify the expression regulation mechanism and interaction network relationship of the key inbred male sterile genes, we plan to study the basic characteristics and transcriptional regulation of key genes by gene cloning, qRT-PCR, immunohistochemistry, RNAi, overexpression, immunofluorescence and Western blot technologies. These studies will provide a breeding guide for BMI reproduction on molecular level and reference on clinical diagnosis and treatment of human male infertility, which has important theoretical significance and application prospects.

版纳微型猪近交系是生物医学的理想实验动物，也是异种器官移植的良好供体，但在35年的繁育过程中有多个亚系断代，前期研究发现主要是由于一些公猪不育导致。针对这一问题，本研究利用高通量技术对相同环境条件下同月龄的近交系不育公猪和正常公猪生殖器官——睾丸及附睾开展转录组和全基因组甲基化高通量测序，结合前期近交系全基因组重测序结果和NCBI上家猪基因组数据，比较两者间的差异表达基因及差异甲基化区域，综合分析鉴定近交系雄性不育关键基因、构建生精障碍功能基因网络。进一步，采用基因克隆、qRT-PCR、RNAi、过表达、免疫荧光和Western blot等技术对关键基因进行基本特性分析和转录调控研究，阐明近交系雄性不育关键基因的表达调控机理及互作网络关系，以期为版纳微型猪近交系扩繁提供分子水平的育种指导，为男性不育的临床诊治提供参考，本研究具有重要的理论意义和应用前景。

应用精液分析、解剖学、组织学方法分析同等饲养水平、月龄、体况相近的版纳微型猪近交系（BMI）和滇南小耳猪（DN）的公猪繁殖性状的差异性，确认了滇南小耳猪的生精能力比版纳微型猪近交系更强。屠宰1岁的BMI和DN各3只（均为全同胞），采用RNA-seq对睾丸附睾mRNA进行了高通量测序和全面比较，BMI睾丸附睾得到187,182,030和151,920.648条reads，DN睾丸附睾得到134,251,838和141,658,382条reads。以FDR<0.05且|log2FC|>1为标准，筛选到睾丸中品种间差异表达基因（DEGs）1404个（上调763个，下调641个），附睾中DEGs 171个（上调80个，下调91个）。睾丸DEGs GO功能富集分析发现57个通路，其中25个被归纳为“生物过程”、17个被归纳为“细胞组分”、15个被归纳入“分子功能”；睾丸DEGs KEGG注释相关通路305个，其中在cAMP信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、cGMP-PKG信号通路、PI3K-AKt信号通路、程序性细胞坏死信号通路、细胞凋亡、肌动蛋白细胞骨架调控、碳代谢分别注释到17、17、15、12、12、18、13、13和12个基因。采用WGBS技术开展BMI和DN睾丸附睾全基因组DNA的甲基化水平检测和分析，品种间睾丸附睾差异甲基化区域（DMRs），在CG环境下为17144、141548个，CHH环境下为42、62个，CHG环境下为25、157个。RNA-seq与WGBS关联分析显示，睾丸CG环境启动子区DMRs与DEGs呈现负相关的有60个基因，附睾中有16个基因，初步认为这些基因的表达可能受到DNA甲基化水平的调控，为进一步研究启动子DNA甲基化对猪精子发生调控的机制奠定基础。本研究获得了BMI与DN公猪生殖器官间存在的大量DMRs和DEGs，为进一步系统挖掘与精子发生相关的功能基因和完善精子发生调控网络奠定理论基础。采用候选基因法，对AR、DAZL、BOLL、Septin12、Septin14、RNF148、ARRDC5基因的组织表达和细胞定位进行研究，这些基因在公猪的生殖器官中高表达，间接推断这些基因会影响猪的精子发生。培养研究生2人，发表1篇SCI论文和4篇中文文章，主持人获得云南省应用基础面上项目1项。