骨桥蛋白在间充质干细胞跨胚层分化过程中的分子机制

Mesenchymal stem cells (MSCs), a widespread adult pluripotent stem cell in mammalian, has been always an area of research focus. However, the differentiation capacity of MSCs cannot meet the illness needs in the application process, which limits the application. Osteopontin (OPN) is a kind of phosphorylated glycoprotein containing RGD (Arg- Gly -Asp) integrin binding sites and important for many physiological functions, including the cell migration and immune. It is reported that the OPN plays an important role in regulating adipogenic and osteogenic differentiation process of MSCs, however, little is known about whether OPN affects the cross mesoderm differentiation of MSCs. Therefore, the present study will examine the induction of OPN on crossing mesoderm differentiation of MSCs through OPN knockout or introduction of exogenous OPN in vivo and in vitro. The changes of expression and activity, and the effects on the differentiation and migration of different OPN receptors will also be studied. The study will find the signaling molecules in the downstream, reveal the regular of signal transfer behavior and further illuminate the mechanism of OPN on crossing mesoderm differentiation behavior of MSCs.

间充质干细胞( MSCs )是一种广泛存在于哺乳动物体内的成体全能干细胞，一直以来都是干细胞领域研究的热点，但在应用过程中其分化能力不能适应病情需要的问题在一定程度上限制了MSCs的应用。骨桥蛋白（OPN）是一种包含RGD（Arg - Gly - Asp）整合素结合位点的磷酸化糖蛋白，在细胞迁移、机体免疫等方面具有重要的生理学意义，研究证明OPN在MSCs成脂和成骨的分化过程中有着重要的调控作用，而对于OPN是否影响MSCs的跨胚层分化则研究较少。因此，本研究拟以OPN为切入点，通过敲除OPN及引入外源OPN，分别从体内和体外实验来观察其对MSCs跨胚层诱导分化能力的影响，探讨OPN不同受体在MSCs分化迁移过程中的表达规律及活性变化，并观察其对分化迁移的影响；找出其下游的相关信号分子，揭示参与介导迁移行为的信号传递规律，并最终阐明OPN影响MSCs跨胚层诱导分化行为的作用机理。

本研究拟探讨OPN不同受体在MSCs分化迁移过程中的表达规律及活性变化，并观察其对分化迁移的影响，进而阐明OPN影响MSCs跨胚层诱导分化行为的作用机理。研究中，我们首先对绵羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行了分离和培养，通过流式细胞术、Real time RT-PCR等技术对其干细胞特性表达因子进行鉴定。同时利用成骨、成神经和成心肌诱导对绵羊BMSCs进行了跨胚层多向分化潜能研究，并成功诱导出了骨细胞、神经胶质细胞和心肌细胞，进而证明了本研究成功获得了绵羊BMSCs 。接下来的研究中，通过Real time RT-PCR技术来检测OPN在BMSCs中的表达情况。发现OPN在P4时的表达量明显高于P2、P3细胞，这也在一定程度上证明了绵羊BMS Cs的自成骨分化趋势。随后，在OPN+- MSC建系过程中，由于细胞自成骨分化严重，在多次尝试后，未能够成功建立OPN+- MSC细胞系。因此，为了保证后期实验的顺利进行，在对前期实验进行重新梳理后，决定首先构建TERT-BMSCs系，通过构建TERT真核表达载体，转入绵羊BMSCs，成功获得了TERT-BMSCs细胞系，并对其进行 了鉴定。在检测其传代培养、细胞增殖和体外诱导分化能力的过程中，我们发现该细胞系能够在体外正常传代至40代，细胞核型正常率仍保持在77.78%；体外诱导分化成神经细胞和脂肪细胞，也证明其仍具有跨胚层多向分化潜能。为进一步探究BMSCs跨胚层分化信号机理，通过高通量转录组测序方法分别检测了绵羊BMSCs和TERT-BMSCs的基因转录组，进一步分析了其成骨、成脂和成神经分化信号通路差异，并计划在下一步的研究中做进一步的分析及验证工作。