金钱鱼肾脏多巴胺在环境盐度适应中的研究

As an important stress response system, the renal dopaminergic system seems playing a key role in maintaining homeostasis in mammals, but few relative studies have been performed in the fish. In our previous study, it has been proved that renal dopamine (DA) participates in the response of acute hyposaline stress and promotes the adaptation of organism to fluctuation of environmental salinity. However, the osmoregulation mechanism mediated by renal DA of fish is not still well understood so far. In the present study, we use the spotted scat Scatophagus argus as the research subject to measure the contents of renal DA under long-term salinity stress through ELISA. Using the customized specific antibodies, combined with immunohistochemistry, western blotting, RNA interference and overexpression, the dopamine receptor subtype involved in the adaptive regulation of salinity will be identified. Furthermore, using IP-MS technology to explore the corresponding downstream interaction proteins of the dopamine receptor, and reveal their functional characterization in vivo and in vitro. Moreover, the influence of different environmental salinity on renal sodium ion secretion will be analyzed, and the expression and activity of related sodium channels (NKA & NHE) will be detected. Ultimately, we will explore the mechanism of sodium balance regulating by DA in the kidney. This study will provide new insights into the adaptability to environmental salinity in marine fish.

肾脏多巴胺系统是机体重要的应激反应系统，对哺乳动物维系体内平衡和体液渗透压的稳定具有重要作用，但这方面的研究在鱼类中知之甚少。申请者前期研究发现，金钱鱼肾脏分泌的多巴胺（DA）参与急性低渗胁迫应答，促进机体适应环境盐度变化。然而，肾脏DA介导的鱼类渗透压调节机制仍有很多科学问题亟待阐明。本研究以广盐性鱼类金钱鱼为研究对象，ELISA法检测长期盐度胁迫下肾脏DA含量变化。利用制备的特异性抗体，结合免疫组织化学、蛋白免疫印迹、RNA干扰以及过表达实验，确定参与盐度应答的受体亚型。利用免疫共沉淀与质谱联用技术，结合课题组已有蛋白质组注释结果，鉴定相应亚型受体的下游互作蛋白，在个体和细胞水平进行功能验证。分析不同环境盐度下钠离子分泌规律，检测相关钠离子通道（NKA & NHE）的表达以及活性变化。最终阐述DA对肾脏中钠离子平衡的调控机制。本研究为探索海洋鱼类的盐度适应性提供新的理论支撑。

鱼类需要通过渗透压调节来维持机体渗透平衡，从而适应环境盐度波动。以往与渗透调节相关的研究主要集中在鳃上；然而，我们对另一个参与渗透调节的器官—肾脏知之较少。海水鱼类的盐度适应涉及渗透调节器官的复杂生理功能、代谢途径以及分子、基因网络。为了进一步探讨海洋鱼类肾脏盐度适应调节机制，本研究采用广盐鱼类金钱鱼作为研究对象。利用RNA-Seq技术对不同盐度水平下的肾表达谱进行了表征，并利用将分子工具与生理生化技术相结合的方法，揭示了体内外的肾渗透调节机制。基于DEGs的功能分类，我们发现肾脏多巴胺介导的Na+转运在渗透调节中起着重要作用。首次在鱼类中发现了许多与多巴胺系统相关的候选基因。环境盐度的变化通过调节与多巴胺再摄取(dat)、囊泡交通介导的多巴胺释放(pink1、lrrk2、ace和apn)、DAT磷酸化(CaMKIIα和pkcβ)和内化(akt1)相关的基因的表达，影响肾多巴胺的释放/再摄取。相关的转录调控确保了金钱鱼肾细胞外多巴胺的适当浓度。体外Nomifensine暴露实验证明，封闭DAT会抑制细胞外DA清除，导致细胞外DA浓度升高。然而，细胞外多巴胺的波动直接对Na+/K+-ATPase (NKA)的表达和活性产生影响，这与Na+稳态有关。此外，我们利用Co-IP技术结合体外暴露实验进一步验证DA影响NKA介导的Na+转运机制。结果发现，DA通过与DR1受体结合激活PKC信号通路，调节NKA活性，并且这一调节机制不影响NKA的表达。这些数据为了解海水鱼类肾脏渗透调节的分子基础提供了依据。值得注意的是，本项目的研究结果揭示了肾多巴胺系统介导的钠离子转运机制在鱼类渗透调节中至关重要的作用。