“分子海绵”lncRNA H19通过let-7和miR200调控胚胎滋养细胞粘附侵袭的机制研究

H19 plays important role in embryo development but how it fuctions during embryo implantation has not been deeply investigated. H19 has several let-7 binding sites and can function as a molecular sponge and antagonizes its functions. Our previous study showed that let-7 target,integrin, is a biological marker for good endometrial receptivity and plays a crucial role in blastocyst implantation. Our previous study also showed let-7 target(HMGA2,cMyc,IMP3) plays important role in tumor cell invasion. We have predicted that H19 also has miR200 binding sites. ZEBs,targeted by miR200,plays important role in cell invasion. So we proposed our hypotheses:H19/let-7/integrin beta could promote the adhesion between trophoblast cells and endometrial cells.H19 could increase the invasion ability of trophoblast cells by H19/let-7/ HMGA2,cMyc,IMP3 axis and H19/miR200/ZEB axis. In this study, We would prove H19 has functional miR200 binding sites by transfection of different plasmids.We would study the effect of H19/let-7 axis on embryo trophoblast cell adhesion and invasion and the role of H19/miR200 axis in trophoblast cell invasion through both in vivo and in vitro experiments. This study would add strength to explore the mechanism of embryo implantation.

H19在胚胎发育中起重要作用，但在着床方面缺乏机制探讨。H19作为“分子海绵”拮抗let-7功能。课题组前期研究表明，let-7的靶基因整合素在细胞粘附中起作用，HMGA2、cMyc、IMP3等靶基因在肿瘤细胞侵袭中有作用。另外，课题组预测H19也含有miR200结合位点，而miR200靶基因ZEB在细胞侵袭中起作用。故本项目假设：H19通过调节let-7/整合素轴促进滋养细胞与内膜细胞的粘附，通过调节H19/let-7/HMGA2,cMyc,IMP3轴和H19/miR-200/ZEB轴增强滋养细胞的侵袭植入。本课题拟通过构建、转染特制的荧光报告载体，证明H19可与miR200结合并抑制其功能，拟通过人体标本、细胞实验和动物实验三个层次研究H19/let-7轴在滋养细胞粘附和侵袭过程中的作用以及H19/miR200轴在滋养细胞侵袭过程的作用。本研究将对深入了解胚胎着床机制有重要作用。

LncRNA H19是最早被发现的非编码RNA。H19在胚胎发育过程中高表达，在出生后表达显著下降。现有证据显示H19在胚胎发育过程中起重要作用，但在胚胎着床方面缺乏机制探讨。胚胎着床包括胚胎粘附、滋养细胞迁移、侵袭等多个生物学过程，滋养细胞侵袭的同时诱导母胎界面血管形成，从而建立并维持妊娠，其中任一过程发生异常均可导致妊娠丢失。本研究旨在研究H19调控滋养细胞粘附、迁移、侵袭及血管形成的机制，为H19在自然流产中的作用提供理论依据。研究分以下三部分：（1）H19在临床标本中定位及表达分析。首先收集早期流产绒毛组织行H19荧光原位杂交（FISH）分析，发现H19在人早期流产绒毛中的表达主要定位于滋养细胞层，H19在细胞滋养细胞及合体滋养细胞中均呈高丰度表达，尤其在绒毛外滋养细胞中发达较高，其中绒毛外滋养细胞在胚胎侵袭过程中起关键作用，而H19在绒毛间质中表达较低。接下来收集复发性自然流产患者（病例组）及同期因非意愿妊娠行人工流产患者（对照组）的绒毛组织，检测H19在两组中的表达情况，发现H19在复发性自然流产患者绒毛组织中的表达较对照组显著降低。（2）体外实验研究H19调控滋养细胞粘附、迁移、侵袭及血管形成的分子机制。我们采用绒毛外滋养细胞系HTR-8为细胞模型。在HTR-8细胞中分别上调或下调H19的表达。结果显示过表达H19可显著增强HTR-8细胞的粘附、迁移、侵袭及血管形成能力，而干扰H19的表达后，HTR-8细胞的粘附、迁移、侵袭及血管形成能力显著降低。且进一步发现H19通过let-7/ITGB3调控滋养细胞球与子宫内膜细胞间的粘附能力，通过miR106a/VEGFA调控滋养细胞的血管形成能力。（3）在临床标本中进一步验证H19在胚胎着床过程中的可能分子机制。ITGB3及VEGFA在自然流产患者绒毛组织中的表达显著下降，H19与ITGB3及VEGFA间表达呈显著正相关。本研究对深入了解H19在胚胎着床过程的作用有重要意义，为复发性自然流产的预测和治疗提供了线索。