miR172在番茄果实形成过程中的功能解析

miR172 is a conserved miRNA in plant, which regulates phase transition of plants in coordination with miR156. It was reported that overexpression of miR156 in tomato led to fruit abnormity, but it is not clear whether miR172 participate in formation of tomato fruit. In our previously study, antisense constuction of pre-miR172b resulted in ectopic fruits, indicating that miR172 plays important role in fruit formation. In this project, microscopic and high-throughput sequencing will be applied to compare the atomomic and transcriptional differences between pre-miR172b antisence and wild type tomato during fruit formation. Immunoprecipitation-Sequencing (ChIP-Seq) and Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) will be employed to identify the target genes of SlAP2 (target gene of miR172). Furthermore, Dual-Luciferase reporter assay system will be used to verify the impact of miR172 on downstream genes via SlAP2. These results will help to reveal the molecular mechanisms of miR172-regulated fruit formation and development, and provide novel gene resource for fruit development and regulation in tomato.

miR172是植物中一类保守的miRNA，可与miR156协同调节植物生长周期。有研究报道在番茄中超表达miR156可以使果实出现异常增生，而本项目在前期研究中发现miR172的前体pre-miR172b的反向沉默植株也会造成果实内部产生次生果，然而其分子机制尚不明确。本项目拟通过组织切片和高通量测序技术研究野生型番茄与pre-miR172b反向沉默株系在果实形成过程中显微结构和基因表达谱的差异，同时利用ChIP-Seq和EMSA技术筛选和验证miR172靶标基因AP2所调控的下游与果实形成相关的关键基因，并在双分子荧光报告系统中验证miR172可以通过影响AP2的表达进而调控下游基因启动子的转录效率。研究结果可以揭示miR172及其靶标基因AP2调控果实发育过程的分子机制，深入阐明番茄果实形成的调控网络。

miRNA是一类重要的调控因子，其通过对靶标基因的同源序列识别而进行抑制。miR172的靶标基因是AP2，其参与到花原基的生存过程。通过对miR172前体pre-172b的反向表达，获得了果实发育异常的表现，但是其表型并不稳定，说明miR172有可能不是导致果实异常的直接原因。再通过定量PCR结果的筛选到miR166在异常的果实中表达升高。于是通过截断的2A11启动子驱动miR166b的表达，获得了类似的果实异常的表型。MiR165 / 166是调节植物中HD-ZIP III转录因子基因的一种类型的保守miRNA。作为miR165 / 166的多功能作用，pre-miR165 / 166的高度组成型表达可能通过根癌土壤杆菌介导的转化对外植体是致死的，这导致在存活的转基因植物中检测到的miR166的轻微过表达。然后使用缩短的2A11启动子（-1至-1395，s2A11）驱动pre-miR166b的表达，并且其在番茄果实中成功地促进miR166的积累并相应地降低了6种HD-ZIP III靶基因的转录水平。出乎意料的是，在第四片复叶之后发育的组织中也检测到增加的miR166，从而导致植物上部的外卷曲叶形成，花芽的停滞发育和开花时间的延迟。值得注意的是，在转基因番茄内部连续产生果实样器官。生长素运输载体SlPIN的转录水平，生长素响应因子SlARF在s2A11 :: pre-miR166b转基因植物中与WT相比下调。此外，转基因番茄果实中也影响细胞命运和花器官确定性的转录因子，包括TAG1、KN1和KN4。此外，miR166还被发现在黑暗处理的植物的花序中与正常日/光条件下的植物相比显着上调，而同时具有5个miR166靶基因的转录物减少，并且能量信号SlTPS1的潜在关键调节物也相应减少。总之，本研究的数据表明miR166通过改变生长素信号通路中HD-ZIP III靶基因和下游调节基因的表达水平来调节果实中的植物生长，叶形态形成和细胞命运决定。另外，在miR166的超表达植株中还观察到了抗旱等有生产意义的表型。