Rho GTP酶在绿僵菌生长发育及侵染致病过程中的功能分析

Rho GTP酶作为调控细胞信号传导途径的分子开关，调控细胞极性生长、细胞形态发生和细胞骨架重组。昆虫病原真菌生长发育与侵染致病过程中伴随着形态的动态变化，是细胞极性建立和细胞骨架重组的结果。申请人从感病蝗虫体内金龟子绿僵菌菌体的cDNA文库中，发现了2个Rho GTP酶家族基因MaRac1、MaCdc42。本项目拟以绿僵菌为材料，克隆MaRac1、MaCdc42基因及上游调控序列；gfp融合表达、定量PCR技术分析MaRac1、MaCdc42的表达特征；超表达、RNAi和基因敲除技术研究MaRac1、MaCdc42与绿僵菌生长特性及毒力的关系。本项目可比较分析MaRac1、MaCdc42在绿僵菌生长发育及侵染致病过程中的作用，对于明确细胞形态调控在病原真菌生长发育、适应环境、侵染寄主中的作用及阐明昆虫病原真菌致病分子机理具重要意义。

Rho GTP酶作为调控细胞信号传导途径的分子开关，调控细胞极性生长、细胞形态发生和细胞骨架重组。昆虫病原真菌生长发育与侵染致病过程中伴随着形态的动态变化，是细胞极性建立和细胞骨架重组的结果。本研究以金龟子绿僵菌为材料，对基因组中Rho GTP酶家族基因进行了序列分析，采用基因敲除技术系统研究了MaRac1、MaCdc42、MaRho2基因在绿僵菌生长发育与侵染致病过程中的功能，获得以下研究成果：.1. 分别构建了MaRac1、 MaCdc42、 MaRho2基因的敲除载体，根癌农杆菌介导进行绿僵菌的遗传转化，并对转化子进行了PCR、Southern杂交及回复突变，确证获得了表型稳定的转化子。并对转化子的菌落表型、孢子及菌丝形态、孢子萌发率、产孢量、抗逆性、毒力进行了系统的研究。.2. MaRac1的缺失影响到绿僵菌孢子的萌发，抗逆性，孢子的耐热性，降低了孢子的抗紫外能力，但未影响绿僵菌在寄主血淋巴中的定殖及生长，体内注射侵染和体表点滴侵染的毒力。.3. MaCdc42的缺失显著降低了绿僵菌孢子的萌发率，附着孢的形成率，影响抗逆性，降低了绿僵菌的产孢量，对湿热的耐性，显著降低了绿僵菌孢子的抗紫外能力，体内注射和体表点滴生测结果表明，Δcdc42虫菌体数量显著少于WT和CP，且孢子萌发状态明显落后于WT和CP，MaCdc42的缺失影响绿僵菌的体表穿透以及虫菌体在寄主血淋巴中的定殖及生长。.4. MaRho2基因的缺失，降低了绿僵菌的抗氧化能力，影响到细胞壁合成，进而影响绿僵菌在生长发育不同阶段的形态变化，但未影响绿僵菌侵染的毒力及对高渗透压的耐受性。 .5. 以半定量RT-PCR检测了MaRac1、Macdc42和MaRho2在绿僵菌附着孢形成阶段，绿僵菌侵入体内3 d（早期），5-6 d（中期），7 d（晚期）等不同时期的表达水平，证实，3个基因在不同阶段表达差异不大。.研究结果表明，Rho GTP酶家族的MaRac1、MaCdc42、MaRho2基因在绿僵菌生长发育与侵染致病过程中功能不同，但又功能重叠。令人意外的是，在绿僵菌的生长发育与侵染致病过程中，MaCdc42比MaRac1在功能更为重要。相关数据撰写的论文正在投稿中。