杨树CLE1多肽通过PXY受体蛋白参与维管发育的功能和调控机理研究

Wood is derived from cell division and cell differentiation of vascular cambium in woody plants. In our previous study, a poplar CLE1 peptide was identified with activity in promoting cell division of vascular cambium. The activity was dependent on PXY, an LRR-RLK gene; and it could be regulated by PXL3 and PXL4, two analogous genes of PXY. This proposal includes the following studies: （1） To understand the function of PtCLE1 in vascular development by its overexpression, ectopic expression, CRISPR-Cas9 mediated gene knock-out analysis; （2） To analysis molecular mechanism of CLE1 peptide in vascular development by characterization of ptpxy knockout lines, by complementation of Arabidopsis pxy mutant with PtPXY gene, and by transcriptomic analysis of the complemented lines treated with CLE1 peptide in an Arabidopsis in vitro peptide application system; （3） To find out the physical interactions between CLE1 peptide and LRR-RLK receptors by Yeast-2-Hybrid analysis, Co-IP, BIFC and ITC technologies;（4） To search for new members in the downstream of the CLE1-PtPXY signaling pathway by combining the abovementioned Yeast-2-Hybrid analysis and transcriptomic analysis. These studies will help us to build up a regulatory network of “peptide ligand- receptor-transcriptional factor” in vascular development, and will be helpful in understanding the mechanism of wood formation.

木材形成源自于木本植物维管形成层的分裂与分化。项目组前期研究中发现杨树CLE1多肽能够促进维管形成层的分裂活性，该促进作用依赖于PXY受体基因，并且受到PXY同源基因PXL3和PXL4的调控。本项目主要研究内容包括（1）通过杨树PtCLE1的过量表达、异位表达和利用CRISPR-Cas9构建基因敲除突变体，解析PtCLE1在维管发育中的功能；（2）构建ptpxy突变体进行其功能验证，通过PtPXY在拟南芥pxy突变体中的互补，以及互补植株多肽体外处理的转录组分析，研究CLE1多肽影响维管发育的分子机理；（3）通过酵母双杂交、Co-IP、BIFC和ITC等方法研究CLE1多肽与PtPXY及其同源受体间的物理互作；（4）综合酵母双杂交和转录组分析的结果挖掘CLE1-PtPXY信号途径下游新成员。本项目的实施有助于维管组织中“多肽信号-受体-转录因子”调控网络的构建和木材形成机理的进一步剖析。

木材的形成源于树木的次生生长，维管形成层活性决定了树木次生生长的能力。各类植物激素共同参与调控维管形成层活性，而其中关于植物多肽类激素的研究仍然是近年的一个热点。项目根据前期的计划开展，并取得了较好的进展。项目主要研究进展如下：为了能准确地对项目中CLE基因进行注释，开发了一种针对短氨基酸序列的新方法，进行69种植物CLE基因的预测与聚类，推断了CLE和IDA家族的亲缘关系；在此基础上，开发了一种基于氨基酸位点频率和位点权重的蛋白质聚类新方法，以HB转录因子（含WOX4）为例，对软件包进行了测试；发现了CLEL的成员也参与了维管组织的发育，并对其成员进行初步功能研究；研究了柳枝稷TDIF-like基因对拟南芥维管发育的影响，推断了PvTDIFL在功能上与拟南芥TDIF相似，但多肽加工方式和活性调控更为复杂；参与了目的基因PttCLE47多肽编码基因促进杨树形成层发育和次生木质部形成的研究；开展了杨树干旱胁迫试验，解析叶片生理生化指标和维管形成层活性的变化。总体来说，项目运用生物信息学手段对杨树CLE家族进行了注释、聚类、候选多肽基因预测、受体基因预测和配体受体互作预测，应用生化手段验证了目标多肽配体和PXY等受体之间的蛋白互作关系，通过杨树和拟南芥的遗传转化分析了CLE26、PXL3/4等基因在维管形成层活性调控中的功能。项目的实施进一步丰富了我们对于树木维管发育中CLE/LRR-RLK/WOX调控网络的认知。