Zeb1通过Numb调节小鼠lewis肺癌干细胞对称分裂的机制研究

The hypothesis of cancer stem cell has been proposed for a long time, but the mechanism how to carry out symmetrical division (SD) and asymmetric division (ASD) is unknown. In this project, the LLC-SD and LLC-ASD derived from murine Lewis lung carcinoma stem cell line were selected. Preliminary work showed that the the tumor fomation ability of the LLC-SD was higher than LLC-ASD. Subsequently, the interference of Zeb1 which is differentially expressed in LLC-SD and LLC-ASD could supress the spheroid fomation in vitro, symmetric division ratio and tumor fomation in vivo in LLC-SD. Then, the interference of Numb which is the important symmetrical division regulation factor also could supress the spheroid fomation in vitro and tumor fomation in vivo in LLC-SD. Finally, we determine that the miR-31 may mediate the regulation between Zeb1 and Numb through ChIP, bioinformatics tool and miRNA experiment. Next, we will explore the relationship between Zeb1, Numb and miR-31through interference and overexpressiong of miR-31.

肿瘤干细胞致癌假说提出已久，但是对于其如何进行对称分裂（symmetric division，SD）和非对称分裂（Asymmetric division，ASD）的机制却是未知的。在本课题中，选取了小鼠Lewis肺癌细胞系来源的肺癌干细胞对称分裂（LLC-SD）和非对称分裂细胞系（LLC-ASD）。前期工作表明LLC-SD体内致瘤能力显著高于LLC-ASD。随后，筛选出了差异表达基因Zeb1，干扰Zeb1能够影响LLC-SD体外成球，对称分裂比率和裸鼠皮下致瘤能力。随后，干扰对称分裂调控因子Numb对LLC-SD的体外成球和裸鼠皮下致瘤能力也产生了显著影响。最后，我们通过CHiP、生物信息学工具及miRNA检测等方法判断Zeb1可能通过miR-31调控了Numb。接下来，我们还将通过miR-31的干扰和过表达实验，进一步探讨Zeb1、Numb和miR-31之间的关系。

本课题在进行过程中，按照研究计划完成所有的研究目标，从体内外的功能指标详尽地探讨了Zeb1-miR-31-Numb调控轴对肺癌干细胞自我更新的影响及机制。其中几个研究内容尤为重要：①确定了Numb在肿瘤干细胞中促自我更新的作用：与大部分文献报道的Numb的抑癌作用相反，我们通过敲低Numb实验以及Zeb1敲低后过表达Numb的挽救实验确定Numb在LLC-SD中可能起到的是促进对称分裂和致瘤的作用；②miR-31介导了Zeb1对Numb的调控：我们通过ChIP实验否定Zeb1对Numb的直接调控作用，并通过miRNA数据库分析和TargetScan筛，再加以双荧光素酶实验验证，确定了Zeb1通过miR-31调控Numb，并且Numb是miR-31的下游靶位点。③对称分裂调控因子对LLC-SD自我更新的调控：在课题进行中，除了Zeb1-miR-31-Numb调控轴以外，我们还发现称分裂调控因子Neur1a和Neurl2参与调控了LLC-SD和LLC-ASD的自我更新，同时Neurl2还介导了另外一个上皮间质转换转录调控因子Twist2对于LLC-SD自我更新的调控。④自噬通过P53调控Zeb1从而影响肿瘤干细胞自我更新的机制：在本课题进行的后期，我探究了Zeb1上游调控因子或者信号通路，我们发现自噬过程会影响Zeb1的表达。随后，我们确定自噬与ZEB1、P53，P53 与ZEB1在人肺癌干细胞中的相互作用及其对肿瘤干细胞自我更新的影响。此部分结果将作为本人下一个面上基金项目申请的基础。. 在本课题的支持下，发表SCI论文 8篇（最高影响因子 6.68），CSCD文章1篇。并成功培养了6名硕士研究生，同时参加了第一和第二届全国肿瘤细胞生物学年会，相关研究成果在大会上作了墙报展示。最后，我们在课题中所探讨的上皮间质转换转录因子Zeb1通过miR-31调控Numb 影响肿瘤干细胞自我更新的机制能够为临床治疗和药物开发提供新的靶位点。