载脂蛋白E对实验性自身免疫脑脊髓炎的血脑屏障通透性的影响及作用机制的研究

The blood-brain barrier disruption, which Leads to infiltration of immune cells into central nervous system, play an important role in in the onset and progression of multiple sclerosis. This role has been confirmed in many research with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS. In our previous work, Our previous study found that ApoE have a protective effect on The blood-brain barrier of EAE , what the mechanism is it? We have found that apolipoprotein E (ApoE) inhibit EAE proinflammatory cytokines, which can promote matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Is the blood-brain barrier related to this mechanism? In addition, there are three subtypes of the human ApoE, ApoE4 is closely associated with neurodegeneration and neuro-immune diseases. According, what is the effect of various ApoE isoforms on the blood-brain barrier of EAE? There is currently no article reported at home and abroad. In order to explain the effect of ApoE on blood-brain barrier, we make the difference of ApoE protein amount and isoforms by induction of EAE using genetically engineered mice. Afterward, we detect the blood-brain barrier permeability and related markers expression by some experiments,including Evans blue experiment, pathological staining, immunohistochemistry, fluorescence quantitative PCR and Western blot and so on. The result of this study not only improve the role of ApoE in the pathogenesis of MS, but also broadens the abilitis of ApoE and its isoforms in neurological disorders.

血脑屏障的破坏在多发性硬化的发病中会导致大量淋巴细胞的浸润，在其动物模型EAE的研究中也证实了这一点。我们前期研究发现ApoE对EAE的血脑屏障有保护作用，其作用机制又是什么呢？我们发现载脂蛋白E（ApoE）能抑制EAE的炎性因子，这些因子具有促进基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的能力，是否与血脑屏障破坏有关呢？此外，人的ApoE有三种亚型，ApoE4与神经变性、神经免疫等疾病关系密切，那么各亚型对EAE的血脑屏障的有什么影响？目前国内外均未见报道。本课题利用基因工程小鼠诱导EAE，制造组间的ApoE蛋白量和亚型的差异，通过病理染色、伊文思蓝实验、免疫荧光、定量PCR、蛋白免疫印迹等实验比较各组血脑屏障通透性和MMP-9等标志物的差异，探索ApoE及其亚型对EAE的血脑屏障通透性的影响及作用通路机制。本课题成果不仅完善了ApoE在MS发病机制中的作用，还拓宽了ApoE及其亚型的作用内涵。

血脑屏障的破坏在多发性硬化的发病中会导致中枢神经系统和外周免疫系统大量淋巴细胞的浸润，在其动物模型EAE的研究中也证实了这一点。我们前期研究发现ApoE对EAE的血脑屏障有保护作用，载脂蛋白E（ApoE）能抑制EAE的炎性因子，这些因子具有促进基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的能力。在ApoE基因敲除型（ApoE-/-）和野生型（WT）背景的C57BL/6J小鼠中诱导EAE，制造组间的ApoE蛋白量的差异，通过病理染色、伊文思蓝实验、免疫荧光、定量PCR、蛋白免疫印迹等实验比较各组血脑屏障通透性和MMP-9等标志物的差异，探索ApoE对EAE的血脑屏障通透性的影响及作用通路机制。首先我们成功诱导了ApoE-/-和WT小鼠EAE模型，发现ApoE缺乏可加重EAE对小鼠造成的神经功能损害，并加重血脑屏障完整性的破坏从而促进炎性细胞侵润，其机制可能与MMP-9的表达增加和活性增强密切相关，提示ApoE在EAE发病过程中对维持血脑屏障完整性可能起保护作用，这可能成为MS/EAE一个治疗靶点。随后发现ApoE缺乏的星形胶质细胞能够上调炎症因子与MMP-9表达，ApoE在小鼠大脑中可能通过P65/ NF-κB炎症通路调节MMP-9表达，导致BBB通透性增加，故我们推测ApoE可能通过免疫调节和炎症通路参与调控MMP-9产生和活化，这为进一步探索MS的确切发病机制提供了一条新的思路。此外，在EAE发病前期脾脏巨噬细胞分泌的MMP-9及炎症因子增多，而ApoE的缺乏进一步促进巨噬细胞分泌更多的MMP-9及炎症因子，故我们推论ApoE可能会通过调节巨噬细胞分泌MMP-9及炎症因子，起到保护血脑屏障完整性、减轻炎症反应的作用，这为MS治疗方面的研究提供了一个新的方向。我们采用转染的技术，将人ApoE亚型（ApoE2,3,4）基因分别转入体外培养的C57BL/6J小鼠的星形胶质细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，从细胞层面来研究ApoE亚型基因对这些中枢及外周免疫细胞的作用的影响，实验已初步完成，结果需进一步验证，数据在整理与统计中。