口蹄疫病毒3C蛋白酶突变体对衣壳前体的剪切活性研究

口蹄疫(FMD)被世界动物卫生组织（OIE）列在A类动物疫病名单之首。在我国，FMD的防控以免疫接种为主，基因工程方法有望提供更加安全有效的疫苗。其中表达FMD病毒空衣壳（VLP）的重组山羊痘病毒（rGTPV）活载体疫苗在反刍动物中具有良好的免疫原性。但是，在rGTPV表达FMD病毒衣壳前体（P1-2A）和3C蛋白酶（3C）组装为VLP的过程中，3C也会结合宿主细胞的mRNA, 诱导细胞快速凋亡，导致rGTPV不能完成生命周期，不具有侵袭力而被免疫系统清除。本研究拟对3C结合RNA的结构域进行定点突变，以同源建模的方法模拟各突变体的结构，进而通过体内外试验检测其对P1-2A的剪切和诱导细胞凋亡的能力。最终筛选到既能有效剪切P1-2A、又不显著诱导宿主细胞凋亡的3C突变体。表达该突变体的rGTPV,在动物体内不但可以组装出FMD病毒的VLP,重组病毒本身也能完成生命周期而具有更高的免疫原性。

在口蹄疫病毒3C蛋白酶的11个与宿主细胞mRNA结合的氨基酸位点进行逐一单位点突变基础上，进行累积多位点突变。同源建模结构显示，5～9位点突变能够保持3C蛋白酶的催化中心结构，又对宿主细胞mRNA结合的位点进行了逼近饱和突变。继而构建表达3C蛋白酶多位点突变体大肠杆菌、野生巨大芽孢杆菌表达载体，发现存在复性困难和难于表达的问题。之后构建枯草芽孢杆菌WB800株的表达载体，确认5～9位点3C蛋白酶突变体诱导宿主凋亡能力显著下降，9位点突变体最低。为检测不同累积位点突变体在哺乳动物细胞内对口蹄疫病毒结构蛋白前体P1的剪切活性，分别构建累积5～9位点的3C蛋白酶与P1共表达的转移质粒，与山羊痘病毒共转染MDBK细胞，最终筛选到的9位点突变体3C-P1重组山羊痘病毒能够稳定传代，间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot能检测到P1蛋白，且能够被有效剪切，电镜能够观察到口蹄疫病毒样颗粒。动物免疫实验表明，该重组山羊痘病毒能刺激动物机体产生最高达1:32的中和抗体，免疫持续期约2个月左右。项目执行过程中，申请国家发明专利1项，一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法’；发表CSCD文章1篇，‘表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建；SCI文章1篇，‘Immunogenicity of capsid precursor and nine site-directed mutant of 3C protease of foot-and-mouth disease virus co-expressed by recombinant goatpox virus’；CSCD文章接受1篇，‘口蹄疫病毒VP1蛋白病毒样颗粒构建’；培养硕士研究生2名。