杆状病毒诱导核内微囊泡形成的分子机理研究

Baculoviruses are applied as promising microbial pesticides. The occlusion-derived viruses (ODV) of baculovirus are responsible for primary recognition and invasion in the insect gut. So far, the mechanism for the morphogenesis of ODV envelope remained unclear. The processes that the inner nuclear membrane buds into the nucleoplasm to form intranuclear microvesicles, which are the precursors of ODV envelopes, have not been elucidated. Our previous studies have demonstrated that, in p48-, ac93- or ac76-knockout bacmid-transfected cells, neither intranuclear microvesicles nor nucleocapsids egressing from nuclei were observed. During mitosis, the reversible depolymerization of nuclear lamina contributes to the breaking and reconstruction of the nuclear envelope; moreover, partial disassembly of lamina is required for the nuclear egress of capsids in herpesvirus-infected cells. Thus, we hypothesize that P48, Ac93 and Ac76 may alter the fluidity of nuclear membranes by regulating the partial disassembly of lamina. In this project, we plan to investigate whether lamina undergoes partial disassembly upon baculovirus infection and the role of p48、ac93 and ac76 in this process. We aim to reveal the mechanism for the formation of intranuclear microvisicles by using methods of molecular biological and virological technology, and immunohistochemistry. The knowledge on the formation of intranuclear microvisicles is significant for understanding the mechanism of baculovirus replication and maturation, and the rules for outbreak of epidemic diseases of insects caused by baculovirus. It is also fundamental for the application of baculoviruses as bioinsecticides.

杆状病毒是一种很有应用前景的微生物杀虫剂，其包埋型病毒（ODV）负责昆虫的口服感染，但ODV囊膜的形成机制尚不清楚，其中内核膜如何出芽形成核内微囊泡（ODV囊膜的前体）更是未见相关报道。我们的前期研究发现：分别缺失杆状病毒保守基因p48、ac93和ac76均导致病毒在感染细胞中不能形成微囊泡，装配成熟的病毒核衣壳也不能出核。我们推测这3个基因的缺失影响了核纤层的局部解聚，阻碍核膜流动性的改变。核纤层通过可逆性解聚调节有丝分裂过程核膜的崩解和重建；在疱疹病毒感染的细胞中核衣壳出核也需要核纤层的局部解聚。本项目拟通过分子生物学、病毒学和免疫组织化学等技术和手段，研究杆状病毒感染是否诱导核纤层局部解聚，p48、ac93和ac76与核纤层解聚的关系以及作用方式，分析微囊泡的形成机制，为揭示杆状病毒的复制、装配机制和流行病的发生规律，更好地利用杆状病毒进行害虫生物防治提供重要的理论基础。

杆状病毒是一种重要的微生物杀虫剂，其包埋型病毒粒子（ODV）负责对昆虫的口服感染，是杀虫毒力和宿主范围的重要决定因子。ODV的囊膜来源于细胞的内核膜向核质方向出芽而成的核内微囊泡，但内核膜出芽形成核内微囊泡的分子机理至今未阐明。真核细胞的内核膜内侧有一层高电子密度的核纤层蛋白网络，该纤维蛋白网是抵抗DNA病毒侵染的天然屏障。那么，内核膜要往核质方向出芽，是否要破坏核纤层这个坚实的屏障呢？本项目构建了一个在Sf9细胞中稳定表达GFP与lamin B融合蛋白的单克隆细胞系，而后通过免疫荧光、免疫电镜等多种方法检测杆状病毒感染的细胞中核纤层蛋白的定位变化，发现病毒的感染能导致在核边缘呈环状分布的核纤层蛋白出现局部弥散，并且从核边缘重新分布到细胞核内，结合到核内病毒粒子的囊膜和核衣壳上，表明杆状病毒的感染引起核纤层的局部解聚。这是在国际上首次报道杆状病毒的感染能引起核纤层的局部解聚，为揭示杆状病毒诱导的核内微囊泡的形成机制奠定了重要的基础。在此基础上，我们分析了杆状病毒感染诱导核纤层解聚的可能机制，发现病毒的感染导致核纤层蛋白的磷酸化，而核纤层蛋白的磷酸化是目前已知的所有核纤层解聚的必要条件，推测杆状病毒感染诱导的核纤层解聚也是因核纤层蛋白的磷酸化而引起的。我们进一步分析了影响核内微囊泡形成的几个保守蛋白是否参与核纤层的解聚，发现这几个蛋白虽然对核纤层的解聚并没有明显的影响，但它们之间存在相互作用，并且在核膜处有明显的共定位，暗示这几个蛋白可能在核内微囊泡形成的其他环节发生功能。对其中的Ac76的深入研究发现该蛋白是一个整合膜蛋白，能形成稳定的二聚体，推测该蛋白通过寡聚化影响了核膜的弯曲出芽从而影响核内微囊泡的形成；而对P48与Ac93相互作用关键氨基酸位点的突变研究显示这两个蛋白的相互作用直接影响核内微囊泡的形成。我们的研究结果揭示了杆状病毒诱导的核内微囊泡形成的关键步骤，为全面阐释ODV的囊膜化机理提供了重要的线索，奠定了重要的理论基础。