磷脂酰胆碱合成酶基因在细菌致病性中的作用与机理

本研究以丁香假单胞菌丁香致病变种（P. syringae pv. syringae Van Hall）为材料,研究磷脂酰胆碱(PC)合成酶基因在植物病源菌致病性中的作用与机理。使用活体定位突变方法敲除pcs和pmtA基因,获得pcs-pmtA-突变体菌株。比较野生型和PC阴性突变株侵染烟草叶的病理症状，评估PC是否与细菌致病性相关。然后利用生化与分子生物学手段调查细菌表面抗原的变化、毒性因子如AvrPto、HrpZ等的表达和分泌以及III型分泌系统的功能等,确定磷脂酰胆碱掺入细菌双分子层膜后影响细菌致病过程中哪些步骤。通过分析比较, 在分子水平上探讨细菌PC影响植物病菌致病性的机制。本研究不仅有助于阐明细菌磷脂酰胆碱在细菌与真核寄主之间相互作用中的功能和深入了解致病菌入侵真核宿主的致病机,而且为后续设计开发新的抗细菌疫苗和药物、控制植物细菌性流行病提供理论依据和新的对策和思路。

丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall CFCC 1336）是一种核果类植物致病菌，它的磷脂组分中除了磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和心磷脂(CL)外，还含有约8%磷脂酰胆碱（PC）。采用同源重组方法，活体敲除丁香假单胞菌丁香致病变种合成PC的关键酶磷脂酰胆碱合酶基因(pcs),获得PC-阴性突变体菌株。敲除土壤假单胞杆菌Pseudomonas sp.593的pcs基因, pcs- 突变菌株也不能合成PC。假单胞菌仅利用Pcs-途径合成PC。比较丁香假单胞菌丁香致病变种野生型和pcs-突变型的毒力，野生型能有效地在大枣果内形成病灶, 病灶随着细菌浓度增大而扩大，pcs- 突变菌株则不产生可见的症状；野生型分泌物能强烈地抑制红曲霉生长，pcs- 突变菌株则不能；野生型细菌能有效地诱发烟草和大豆叶片出现超敏反应，pcs- 突变菌株则不能。进一步生化分析发现，野生型细菌能有效地分泌III型分泌系统（T3SS）依赖的效应蛋白HrpZ和AvrB，pcs- 突变菌株则不分泌。从香假单胞菌丁香致病变种中克隆hrpZ基因,并通过pMEKm-12质粒导入无hrpZ基因的土壤假单胞杆菌593野生型和pcs- 突变型。含外源hrpZ基因的593野生型既表达也能分泌HrpZ,而含外源hrpZ基因的pcs- 突变型只表达HrpZ而不分泌。证明PC的缺失影响T3SS-依赖的效应蛋白的分泌。抽提丁香毒素并进行HPLC分析,发现pcs- 突变型仅分泌微量的丁香毒素,而野生型菌株分泌的丁香毒素是pcs- 突变型的3倍以上。PC的缺失严重影响丁香毒素的有效分泌。使用RT-PCR技术检查6个与T3SS相关或与丁香毒素合成相类的基因在转录水平上的表达,发现这6个基因的表达在野生型和pcs- 突变型之间并无显著性区别；利用Western Blot技术检查5种与T3SS相关或与丁香毒素合成相类的蛋白在转译水平上的表达, 野生型和pcs- 突变型之间也未见显著性差异。因此，在细菌毒力方面，细胞膜中的PC扮着十分重要的作用。PC主要是通过影响膜中的分泌系统的功能影响毒性大分子的分泌。