ZHX3在成骨诱导分化中的作用及机制研究

干细胞（种子细胞）的定向诱导分化是组织工程骨缺损修复的研究热点。有研究表明，ZHX3可作为间充质干细胞向成骨细胞分化的早期标志物，而我们前期的抗体封闭实验也证实，抑制ZHX3可以削弱间充质干细胞的成骨活性，但是其在成骨诱导分化中的作用及机制尚不清楚。为此，本课题拟采用基因芯片技术筛选出与ZHX3差异表达的成骨分化相关基因；选用ZHX3高表达、低表达的干细胞定向诱导成骨后，证实ZHX3在干细胞成骨样分化过程中的作用；并进一步从蛋白质相互作用角度阐明ZHX3与TGF-β1/Smad通路关键分子的相互作用，探讨ZHX3促进成骨样分化的分子机制，为干细胞成骨诱导分化的研究奠定理论基础，为解决临床上植骨材料的不足提供实验依据。

骨缺损主要由于某些先天性疾病或后天性疾病（感染、肿瘤、创伤、骨髓炎清创术等）丧失了一些骨质，形成了较大的间隙所致。目前治疗大面积骨缺损所需的植骨材料不足问题，主要采用组织工程骨来替代。支架材料、诱导因子和干细胞（种子细胞）为构建组织工程骨的三大要素，其中种子细胞是该研究的核心内容。干细胞（种子细胞）的定向诱导分化是组织工程骨缺损修复的研究热点。有研究表明，种子细胞诱导分化为成骨细胞的关键可能取决于早期调控的转录因子。锌指蛋白和同源框3（zinc fingers and homeoboxes 3，ZHX3)是成骨分化早期的标志物，在成骨分化过程中起着至关重要的作用，可能是MSCs从未分化阶段向成骨分化过程的转换开关，与晚期出现的标志物相比能够更早、更快的识别干细胞的成骨潜能。为了阐明这种调控作用的分子机制，我们采用ZHX3过表达慢病毒载体转染大鼠BMSCs、ADSCs，于体外培养，经定向成骨诱导21d后采用碱性磷酸酶和茜素红染色观察各组细胞成骨能力，结果显示，ZHX3过表达组成骨能力（碱性磷酸酶、矿化结节含量）显著高于未转染组，提示ZHX3基因具有明显的促进成骨能力。进一步采用成脂诱导液和成软骨诱导液作用于ZHX3高表达的BMSCs，采用Ⅱ型胶原和油红O染色，发现ZHX3基因对成软骨和成脂方面无显著作用。骨缺损移植体内实验证实，KD-ZHX3/BMSCs移植组、KD-ZHX3/ADSCs移植组修复速度要慢于单纯BMSCs移植组、ADSCs移植组和对照组。采用免疫荧光和免疫印迹检测发现smad3、smad4、RUNX2、BMP2，phos-smad1在空白对照组和ZHX3沉默组之间有显著差异。进一步采用Affymetrix 大鼠基因表达谱芯片检测KD-ZHX3/BMSCs和空载病毒转染BMSCs之间的差异表达基因。筛选两组间差异倍数（经log2 转换）2倍以上的基因为差异表达基因。筛选出737 个差异表达基因，其中246 个表达上调，491 个表达下调。进一步采用IPA分析ZHX3上游及下游蛋白之间的相互作用，发现BMSCs中ZHX3沉默后，显著上调的因子有CYP26B1、MDM2等，且其上调抑制了BMSCs的分化；显著下调的因子有SERPINE2、IFNGR1等，且其下调显著抑制了BMSCs的分化。研究证实，CYP26、CCR1、等均直接或间接参与了成骨分化过程。