海洋纤毛虫共生菌多样性、系统发育及与环境的关系

原生动物共生菌的研究对理解真核生物的起源与进化、微生物相互作用、在生物地球化学循环的功能与贡献等具有重要意义。自然环境（淡水、海洋、土壤）及生物体内环境（如肠道等）中生活的多种纤毛虫均有原核生物共生体（细菌、古菌），但由于共生菌大都难以培养，因此难以通过传统微生物学方法的进行鉴定，迄今多种共生菌的身份、多样性等还有待研究。本项目拟以山东半岛近海环境中的纤毛虫为例，观察与筛选共生体系，在鉴定纤毛虫宿主的同时，通过16S rRNA基因测序、荧光原位杂交等技术对胞内、体表的共生菌进行鉴定，刻画其多样性，探讨其系统地位，并分析纤毛虫-共生菌体系与环境条件的关系，从而揭示海洋纤毛虫-原核生物共生的发生、种类与分布的一般规律与生态学意义。研究结果有望为纤毛虫与共生体的协同进化、环境微生物多样性、共生体的功能与作用等基础研究提供重要参考。

海洋纤毛虫多样性很高，作为细菌、微藻等微型生物的捕食者，是海洋微生物环中发挥重要的功能。在20年里，我国学者在海洋纤毛虫分类学及多样性研究走在世界前列，已有非常好的积累。然而，对经常观察到的纤毛虫与原核生物共生现象的研究却大大滞后；在分子与基因组时代，着手原生动物-原核生物共生研究的第一步，便是利用现代技术对共生菌的鉴定及多样性研究。原生动物共生菌的研究对理解真核生物起源于进化、微生物在海洋生物地球化学循环的功能与贡献等有重要意义。若干纤毛虫的共生菌都难以体外培养，不能通过传统微生物方法的进行鉴定。本项目拟通过16S rRNA基因测序、荧光原位杂交等技术，对海洋环境中的纤毛虫的内、外共生菌进行鉴定，刻画其多样性，并探讨其系统地位。研究结果有望为纤毛虫与共生体的协同进化、环境微生物多样性来源细分、共生体的功能与作用等基础研究提供重要参考。项目组在烟台、青岛近岸海水、半咸水等区域采集纤毛虫约30余种。通过在实验室培养或直接分离，从形态学角度对所有种类做了鉴定。将受试虫体置于无菌水中，饥饿一定时间（通常6~24小时）后，挑取少量细胞提取基因组DNA，以其为模板进行16S 与18S rRNA基因的分子克隆、测序、系统发育分析。采用我们新设计的或前人已发表的寡核苷酸探针进行荧光原位杂交试验，确定共生菌在原生生物细胞中所处位置（体表/体内，大核/小核/胞质）。我们也试图通过高通量测序同时获得海洋沉积物中纤毛虫与细菌两方面的数据，通过他们之间的共存关系推测纤毛虫-细菌共生关系的联系。通过在实验室控制单一环境因子，重点开展了3种生态因子（溶解氧、光照、温度）及2种环境污染物（抗生素、重金属）对纤毛虫共生菌群落影响研究。我们首次在原生生物体内发现一种新的OD1细菌，并命名为“烟台索尼本菌”（新属、新种）；海洋纤毛虫中的细菌多样性非常高，并且在不同细菌门类中均有分布，但伽马变形菌纲与阿尔法变形菌纲的类群占多数；总体来看，溶解氧、光照、温度、抗生素、重金属浓度的不同对两种纤毛虫种共生菌的种类与组成有显著影响，但又一定的差异性。沉积物中的原生生物类群已经做了多样性的分析，与细菌共生网络在整理中。研究结果对理解原生动物与细菌的共存关系及全球变化背景下微型生物的生态适应机制提供了重要参考。