猪星状病毒调控I型干扰素反应的分子机制

Recent studies have shown that astroviruses (AstVs) induce mild and delayed IFN response upon infected host cells, but it is not clear about the molecular mechanism of modulation of type I interferon inducted by AstVs. Our laboratory has been isolated two strains of Porcine astroviruses (PAstV1-NNJG7 and PAstV1-GX1), both can be passaged steadily, and an infectious cDNA clone of PAstV1-GX1 strain has been established successfully. This research will take full advantage of these favorable conditions, investigate the production of type I interferon inducted by porcine astroviruses by dual-luciferase assay, qRT-PCR, Western blot, etc. And discovery of related protein composition and the target signal molecule of PAstVs modulate type I interferon by construction of eukaryotic expression plasmid, dual-luciferase assay, Western blot, confocal microscopy, RNAi assay and immune coprecipitation test, etc. Finally, verify the above research results by construct mutant strains by reverse genetics technique. This aim of this project was clarify the molecular mechanism of modulation of type I interferon induction by PAstVs, provide a scientific basis for studying the molecular characteristics and immune escape of PAstVs.

最新研究表明，星状病毒感染宿主细胞可以诱导产生缓和且延迟的干扰素反应，但是关于该病毒调控I型干扰素反应的分子机制尚不清楚。本实验室前期已经分离得到两株能够稳定传代的猪星状病毒（PAstV1-NNJG7和PAstV1-GX1），其中一株（PAstV1-GX1）已成功构建感染性cDNA克隆。本研究将充分利用这些有利条件，通过双荧光素酶试验、qRT-PCR、Western blot等方法探究猪星状病毒诱导I型干扰素的产生情况。再通过构建真核表达质粒、双荧光素酶试验、Western blot和激光共聚焦实验、RNAi实验，免疫共沉淀试验等探究PAstV调控I型干扰素反应的相关蛋白组分和靶信号分子，最后通过反向遗传技术构建突变株，验证以上研究结果。本项目旨在阐明猪星状病毒调控I型干扰素反应的分子机制，为研究该病毒的分子特征、免疫逃避等提供科学依据。

猪星状病毒属星状病毒科星状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，有五个基因型。目前猪星状病毒在全球范围广泛流行，目前有超过80种动物能够感染星状病毒，在国内猪群中也普遍存在。猪星状病毒具有一定致病性，实验表明病毒感染仔猪后会出现腹泻，减重，肠绒毛萎缩等病变。近些年来不断有学者发现，哺乳动物星状病毒具有跨种间基因重组的可能性，具有较大的可能进化成新型人畜共患病病原的风险，表明猪星状病毒具有重要的公共卫生意义。但目前对星状病毒调控I型干扰素反应的分子机制尚不清楚，本实验室通过病毒分离得到能够稳定传代的猪星状病毒1型毒株（PAstV1-GX1），充分利用双荧光素酶试验、qRT-PCR、Western blot等方法，发现猪星状病毒感染PK-15细胞12hpi后诱导IFN-β的表达。通过使用IRF3和NF-κB抑制剂BX795与BAY11-7082药物抑制实验，发现PAstV感染PK-15细胞通过IRF3途径产生IFN-β。通过使用siRNA干扰RIG-I/MDA-5信号通路，发现siRIG-I、siMDA-5处理组的IFN-β启动子活性显著降低，且siRIG-I、siMDA-5处理后PAstV感染PK-15细胞病毒的感染效率降低。通过CRISPR/Cas9技术成功构建敲除MDA-5蛋白的PK-15细胞系可降低PAstV的感染效率。由此我们推测PAstV感染PK15细胞可能通过RIG-I、MDA-5途径产生IFN-β，且产生的干扰素有利于病毒自身复制。除此之外，通过构建非结构蛋白的真核表达质粒转染HEK-293T细胞，并使用poly(I:C)刺激得知非结构蛋白NS4可抑制由poly(I:C)刺激的产生的IFN-β，且NS4能抑制细胞的IL-6的转录水平。综上所述，本研究实验结果表明PAstV感染PK-15细胞能通过RIG-I/MDA-5通路诱导IFN-β产生，干扰RIG-I/MDA-5或敲除MDA-5后IFN-β的表达显著下降，同时PAstV的复制与感染率也显著降低，且筛选到了拮抗I型干扰素反应的相关蛋白组分，为接下来进一步研究该病毒的分子特征、免疫逃避等提供科学依据。