突变p53的增益性功能对骨肉瘤发展转移及其耐药性作用的研究

Osteosarcoma is the most frequent malignant bone tumor in children and adolescents. The causes of tumor initiation, lung metastasis and the chemo resistance are unclear, current treatments are less effective. p53 point mutations are very common and show gain of function in osteosarcomas, our previous findings indicate that up regulation of PLA2G16 by p53R175H promotes osteosarcoma metastasis and chemo resistance via the MAPK pathway (PNAS 2014; Oncotarget 2016). In our preliminary studies, we have have constructed a lentivirus expression library with a "barcode" sequence to cover three hundred and sixty p53 point mutations commonly observed in cancer patients. Thus, we will carry on the following studies in this proposal: (1) Utilizing the lentivirus mutant p53 expression library to infect osteosarcoma cell lines, and determine the p53 mutations having the highest potency in OS transformation, metastasis and chemo resistance. (2) Using RNAseq and Mass spectrometry methods, we will identify mutant p53 induced key genes and proteins which contribute to the increased osteosarcoma transformation, metastasis and chemo resistance. Then we will carry out intervention experiments both in vitro and in vivo. (3) We will collect patient tumor specimens to determine whether TP53 mutations are associated with lung metastasis and survival. This project will reveal the molecular mechanisms of mutant p53 gain of function in osteosarcoma, and it will help to develop novel diagnosis and therapies for osteosarcoma.

骨肉瘤(OS)是青少年中最常见的恶性骨肿瘤，其发病、肺转移和对化疗耐药性的原因不明，缺乏有效的治疗方法。p53点突变在OS中多发且具有增益性功能，申请人前期研究发现p53点突变R175H可诱导PLA2G16上调，导致MAPK通路磷酸化升高促进OS转移和产生耐药性(PNAS 2014; Oncotarget2016)。预实验发现不同p53突变的增益性功能程度不同，进而构建了具有“条形码”的慢病毒表达库覆盖了肿瘤中常见的360个p53突变。本项目将利用该慢病毒表达库感染OS细胞并筛选出转化转移能力强，具有耐药性的p53点突变。通过RNAseq和Massspectrometry方法鉴定在OS转化转移和耐药性中受p53 突变调控的关键基因和蛋白，并进行体外体内干预实验。收集临床样本，研究肺转移和存活期与TP53突变的关系。最终揭示突变p53增益性功能在OS中分子机制，有助于发现新的诊断和治疗方法。

背景：骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年，由于其极易发生早期异位转移，且有较高的致死率，成为严重威胁儿童和青少年生命健康的病患之一。骨肉瘤早期异位转移最常见的靶器官是肺，约占90%左右，其发病、肺转移和对化疗耐药性的原因不明，缺乏有效的治疗方法。p53点突变在OS中多发且具有增益性功能，这让我们意识到p53可能在骨肉瘤发生发展中发挥了重要作用。.主要研究内容：通过本项目的研究确定突变型p53在具有肺转移的骨肉瘤中具有稳定表达，同时突变p53对骨肉瘤细胞的转化、转移和耐药性都十分重要，或可作为一个切入点，来开发治疗骨肉瘤的新靶点。对不同突变p53调控的下游信号传导通路的研究，不仅可以让我们了解不同突变p53增益性功能的作用机制，也为我们寻找治疗骨肉瘤的新方法提供了基础。对骨肉瘤临床样本的分析，将确定不同突变p53或其下游差异转录和表达的基因作为骨肉瘤恶化、转移、复发的临床生物标记物的可行性，还将确定不同突变p53对骨肉瘤形成的影响，也为骨肉瘤的治疗提供了新思路。.实验结果：我们构建了具有“条形码”的慢病毒表达库覆盖了肿瘤中常见的360个p53突变。利用该慢病毒表达库感染OS细胞并筛选出转化转移能力强，具有耐药性的p53点突变。鉴定出了在OS转化转移和耐药性中受p53突变调控的关键基因和蛋白，并进行了体外体内干预实验。收集临床样本，研究了肺转移和存活期与TP53突变的关系。最终揭示了不同突变p53与骨肉瘤发展、转移和耐药性上的相关性，确定了不同的突变p53赋予骨肉瘤在转化性、转移性和化药耐药性上的分子机制。同时通过高通量测序探讨了新的转移和复发的骨肉瘤临床标示物。.结论及科学意义：我们阐明了不同p53突变的增益性功能程度不同，为突变p53在其他肿瘤中的获得性功能研究提供可行方案和思路，有助于发现新的诊断和治疗方法，为未来临床治疗和药物开发提供了理论基础。