利用秀丽线虫研究植物乳杆菌对ETEC感染的干预及保护机制

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is a major pathogen causing diarrhea. There is a growing concern over the practice due to the wide spread of antibiotic-resistance in zoonotic bacterial pathogens, which poses a threat to public health. Thus, control strategies of the pathogen by lactic acid bacteria is acknowledged to be a potential alternative to antibiotics.The mechanism of lactic acid bacteria against ETEC is still not clear because of the complexity of mammalian models of intestinal flora, clinical interference, animal generation cycle length, different result in vitro with in vivo experiments. Caenorhabditis elegans is an ideal model for host and bacteria researches with its simple, highly conserved features used to underline the effect of Lactobacillus against ETEC and regulation on C. elegans immune signal pathways by using RT-PCR, fluorescence-labeled nematodes, gene silencing (iRNA), gene- knockout nematodes and western blot basing on previous results. The present study will not only helping for understanding the mechanism of Lactobacillus against ETEC, but also provided the theoretical foundation and scientific evidence for development of functional food of Lactobacillus.

产肠毒大肠杆菌是导致细菌性腹泻的主要病原菌。由于抗生素的滥用导致ETEC的耐药性问题日趋严峻。利用乳酸菌来预防或辅助治疗ETEC的感染是学界普遍认可的安全有效的途径。但基于哺乳动物模型肠道菌群的复杂性、临床数据干扰多、动物世代周期长的局限，体外模型和体内实验结果缺乏高置信度关联的制约，致使乳酸菌干预ETEC感染的分子机制迄今仍不明晰。秀丽隐杆线虫具有肠道简单、免疫系统高度保守等特点，已成为现今研究微生物与宿主相互作用的理想模式生物。本课题在前期筛出具有抗ETEC活性的植物乳酸菌的基础上，拟将进一步从免疫调控、信号转导等领域入手，采用基因敲除、基因沉默、RT-PCR、Western blot等手段，研究植物乳酸菌通过线虫的信号通路及下游免疫途径干预ETEC感染的机理。研究结果将有助于全面认识益生乳酸菌在抗ETEC感染中发挥有益作用的分子机制，为功能性乳酸菌的开发提供理论依据和新的思路。

秀丽隐杆线虫具有肠道简单、免疫系统高度保守等特点，已成为现今研究微生物与宿主相互作用的理想模式生物。本课题在前期筛选出具有抗ETEC活性的乳酸菌的基础上，拟通过秀丽隐杆线虫动物模型研究乳酸菌拮抗ETEC保护宿主的分子机制。（1）秀丽隐杆线虫可作为食源性致病菌感染研究的模式生物。（2）食源性致病菌ETEC和沙门氏菌能加速秀丽隐杆线虫衰老，增加其肠道的光密度值，导致世代时间显著延长，出现严重的运动行为障碍，并且与浓度呈线性关系。筛选出有保护效果的乳酸菌能显著缓解致病菌的毒性作用。（3）研究了秀丽隐杆线虫感染食源性致病菌后主要免疫基因的表达，当感染食源性致病菌时，MAPK途径的nsy-1，sek-1，pmk-1和Daf-2/Daf-16途径的daf-16表达显著增加，抗菌肽基因lys-7，spp-1，abf-2，clec-85，abf-3的转录显著上调，并且只有活的乳酸菌可以进一步刺激与MAPK途径，Daf-16途径和抗菌肽基因相关的宿主防御基因的转录。（4）当秀丽隐杆线虫主要防御基因敲除后，Daf-2/Daf-16途径的突变体Daf-16、Pdk-1、Akt-1，MAPK途径的突变体Tir-1、Nsy-1、Sek-1、Pmk-1，细胞程序死亡途径的突变体Ced-3、Ced-9都高度易受ETEC感染。相反，突变体Dbl-1、Daf-4等对ETEC感染的抵抗力更高。这些结果表明，除了MAPK和Daf-2/Daf-16途径外，细胞程序死亡途径及一些其它免疫基因bar-1也参与其中。（5）当我们观察乳酸菌对基因缺陷型秀丽隐杆线虫的保护效果时发现，乳酸菌对细胞程序死亡途径的Abl-1、Ced-4、Ced-3、Ced-9突变体，其它途径的Skn-1、Sod-3、Dbl-1、Daf-4突变体均有保护效果，而对Daf-2/Daf-16途径的大部分突变体，MAPK途径的突变体，以及抗菌肽基因突变体Lys-7、Spp-1、Abf-3无保护效果，这些结果表明，乳酸菌对秀丽隐杆线虫的保护作用位点和细胞程序死亡途径无关，主要和MAPK和Daf-2/Daf-16途径以及抗菌肽基因有关。研究结果将有助于全面认识益生乳酸菌在抗食源性致病菌感染中发挥有益作用的分子机制，为功能性乳酸菌的开发提供理论依据和新的思路。