固氮斯氏假单胞菌的氮信号传导与调控网络研究

固氮微生物氮代谢级联调控系统涉及一般氮代谢调节和固氮基因特异调控蛋白NifLA等多个蛋白的参与，其中铵转运蛋白AmtB（亦有报道是GlnD）被认为是目前已知的最上游的信号感应分子，但机制不详且争议很大。关于氮信号如何传递至AmtB以及微生物对外界氮素信号变化的快速响应机制鲜有报导。本研究拟在成功完成联合固氮斯氏假单胞菌A1501基因组测序及建立成熟基因表达谱平台基础上，采用高浓度铵冲击固氮体系以获得外界因子刺激后A1501菌的基因表达谱，通过基因聚类，结合生物信息学分析及基因功能鉴定，鉴定新的氮信号传导基因，提出一套氮信号传导至AmtB及其他调控节点蛋白的信号传递模式，明确新基因在调控网络中的作用，为揭示联合固氮微生物的氮信号传导与调控网络机制提供重要的理论基础。

固氮微生物的氮代谢调控系统复杂高效，是相关领域的研究热点之一。为了研究联合固氮施氏假单胞菌氮信号响应机制及固氮基因的表达调控网络，本课题采用功能基因组学研究手段开展工作，取得了大量研究结果，发表学术论文12篇，其中SCI论文6篇，这些研究结果为揭示联合固氮微生物的氮信号传导与调控网络机制提供重要了的理论基础。.本研究取得的主要结果如下：.（1）采用全基因组芯片技术开展了该菌在不同生长条件下的基因表达谱研究。通过分析铵冲击和固氮条件下的全基因组表达谱，发现A1501菌中49kb的固氮岛不仅在结构组成上呈现出基因岛的特征，在基因表达模式上也表现出“表达岛”的特征，进一步分析了基因岛内所有基因的启动子，结果表明，在该基因岛内所有的固氮基因组成了多个转录单元（Operon）。其中有十一个转录单元的上游启动子序列既含有氮代谢专用Sigma 54因子RpoN的保守识别序列，也发现了固氮正调控因子NifA的识别序列；.（2）基因表达谱分析比较发现，在A1501固氮条件下高表达的255个基因中，有166个基因在铵冲击10分钟后表达下调。这些基因中有95个基因在另外两株联合固氮菌Azotobacter vinelandii AvoP（棕色固氮菌）以及Azoarcus sp. BH72中都存在。将这95个基因成为联合固氮菌固氮基因表达所需的核心组。通过突变株构建及功能分析鉴定了其中8个可能参与氮信号传导的转录因子和膜蛋白，明确了固氮岛内新基因pnfA的功能；.（3）研究了铵转运载体AmtB在氮信号传递以及固氮基因表达调控中的具体功能，并开展了其作用机制的研究；结果表明AmtB蛋白在铵冲击条件下参与了A1501菌固氮酶活调节。突变株△amtB在固氮条件下具有泌铵能力，而将持续表达nifA的质粒PVA3转入突变株和野生型中，泌铵量增加了一倍，而野生型没有变化，表明AmtB在维持细胞内铵浓度方面起着重要的作用；.