先天性肛门直肠畸形相关P63基因突变致病机制的研究

Anorectal malformations (ARMs) are among the most common congenital anomalies which influenced the quality of life of the patients severely. However, as ARM is a multigenerational complex disease, the etiology, embryology,and pathogenesis of ARM were poorly understood and controversial. Upon on the earlier study of a family with intrafamilial clinically variable manifestation of Split Hand-Foot Malformation association with anorectal malformation,affected individuals were found to have a P63 gene mutation c.797G>A(p.Arg 266Gln).In our study，inmmnofluorescenc (IF),WB,dual-luciferase reporter assay and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) were undertaken to analyze the preliminary functional characterization of the mutant genes.Furthermore, construction of p63 R266Q knock in mice,whole mount in situ hybridization was used to screen the differential expressions of candidate genes which may contribute in the pathogenesis of congenital anorectal malformations.

先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARMs)是小儿常见的消化道畸形，其病因至今仍不清楚。前期对一肛门直肠畸形合并肢体畸形家系研究中发现P63基因第6外显子发生错义突变c.797G>A(p.Arg 266Gln)。在此基础上本研究进一步采用体外电泳迁移率实验、定量PCR、蛋白质免疫印迹、报告基因实验考察突变体DNA结合位点及其在细胞内对靶基因表达的影响；结合转基因技术，构建knock in基因小鼠动物模型，观察胚胎期肛门直肠演变规律，应用全标本包埋原位杂交技术等技术验证差异基因是否在肛门直肠发育特定阶段表达及是否存在差异，明确P63基因及其调控网络在胚胎肛门直肠发育与ARM发生的内在关系，为ARMs遗传干预和畸形防治奠定基础。

背景：肛门直肠畸形（anorectal malformations，ARMs）是小儿常见的先天性消化道畸形，病因及胚胎形成机制至今未完全阐明。目前认为，肛门直肠畸形的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，流行病学和动物实验表明，遗传因素在其发病过程中发挥重要作用.主要研究内容：以前期对一肛门直肠畸形合并肢体畸形家系研究中发现P63基因第6外显子发生错义突变（R227Q）为切入点，（1）P63 Arg 266Gln构建：取人表皮成角质细胞（keratinocytes），构建P63 Arg 266Gln突变慢病毒高表达质粒，包装慢病毒，转染人表皮成角质细胞（keratinocytes）压力筛选使转染效率达到80%以上，转染空载体与转染P63 Arg 266Gln突变载体的人表皮成角质细胞（keratinocytes）高通量测序测（LncRNA，mRNA及环状RNA）；（2）靶基因功能检测：体外转录/翻译系统和EMSA、双荧光素酶报告基因等技术实验，观察体外环境下/p63R227QTAp63R227Q/△Np63R227Q突变体与靶基因的结合以及是否获得了新的DNA结合位点及对靶基因表达的影响及可能的机制。（3）利用免疫组化，western 及PCR方法检测了靶基因在肛门直肠畸形大鼠末端直肠的表达；（4）全外显子测序：对ARMs家系中患者进行全外显子测序，以期发现新的可能致病突变基因。.重要结果: 证实P63基因亚型TAp63R227Q/△Np63R227Q突变体与靶基因的结合DNA结合位点及对靶基因表达无显著差异，而p63R227Q与靶基因的结合DNA结合位点发生改变，对靶基因的表达下调具有统计学差异；DLX5/BMP7/ Msx1在肛门直肠畸形大鼠末端直肠的表达，与正常对照组对比分析，实验结果统计学差异显著，推测出该基因可能与肛门直肠畸形直肠末端发育存在一定相关性。对ARMs家系中患者进行全外显子测序，经过生物信息学分析后发现有2个基因可能与ARM的发病有关 ：PDE4DIP和ANAPC1突变.关键词：p63R227Q 功能;function、DLX5、BMP7、Msx1 anorectal malformations.其科学意义：该研究以一先天性肛门直肠畸形合并少见型手足畸形家系为切入点，在前期研究的基础上进一步明确P63基因及其调控网络在胚胎肛门直肠发育与AR