新磷氮霉素A生物合成关键基因功能研究

Neophoslactomycin A(PLM A), a natural compound discovered from a Streptomyces strain AGR0001, posesses potent activity against virus, tumor, and phytopathogenic fungi, with high efficacy, less cytotoxicity, non-irritation, and low allergenicity. PLM A has huge application potential in pesticide and medication. The structure of PLM A is different from that of the other reported phoslactomycins, which has been filed for patent. In this project, we are going to carried out studies on the gene cluster that is responsible for PLM A biosynthesis. The function of key regulatory genes and post-modification genes involved will be studied to illustrate biosynthetic pathways of PLM A, as well as the mechanism of its regulation. The study would set up the foundation for further increasing PLM A production or acquiring analogs with novel structure through genetic manipulation.

新磷氮霉素A是我们从链霉菌AGR0001菌株中筛选出的高效、低毒、无刺激性、低致敏性的天然化合物，具有抗作物病原真菌、抗病毒和抗肿瘤活性，在农药及医药方面具有极高的应用潜力。新磷氮霉素A的结构与已报道的磷氮霉素类化合物有明显差异，已申请专利，是具有自主知识产权的新化合物。本项目拟对链霉菌AGR0001中参与新磷氮霉素A生物合成的基因簇进行研究，确定参与新磷氮霉素A合成的关键调控和后修饰酶基因并对其功能进行研究，探明新磷氮霉素A生物合成途径及其调控机制，为进一步对其生物合成进行遗传改造，特异性地提高新磷氮霉素A的产量或得到结构新颖的类似物奠定基础。

新磷氮霉素A是我们从金黄色链霉菌Streptomyces auratus sp. AGR0001中筛选到的抗作物病原真菌的天然化合物，具有良好的室内及田间抗番茄灰霉病菌的活性，对作物及非靶标有益生物无不良影响，并且对哺乳动物的急性经口和经皮毒性为低毒，对皮肤和眼睛无刺激性，是非常有前途的抗真菌生物农药先导化合物。但是新磷氮霉素A产量低，严重影响了其在农业和医药领域的进一步应用。本项目对新磷氮霉素A生物合成关键基因进行研究，以期了解这些基因的功能及其对新磷氮霉素A产量的影响，为深入研究其生物合成机理及通过遗传改造获得高产工程菌株奠定基础。.项目首先完成了新磷氮霉素A产生菌的全基因组测序和注释工作，结果整理并提交到GenBank数据库中。通过生物信息学分析，在基因组中定位了磷氮霉素生物合成的基因簇，对该基因簇进行了拼接和补充完善，得到了比较准确、完整的磷氮霉素生物合成基因簇。利用软件对该基因簇进行了基因查找和注释，对参与新磷氮霉素A生物合成的关键基因进行了分析和功能预测。建立并优化了新磷氮霉素A产生菌S.auratus sp.AGR0001的遗传操作体系，挑取了21个磷氮霉素生物合成的关键基因进行了突变株构建，首先在大肠杆菌中构建含突变基因的质粒，共获得了15个突变基因，通过属间接合转移在链霉菌中成功构建了4个突变株，分别是orf 5、orf 15、 orf 42和nsdA。通过发酵产物及生物活性检测，发现这4个突变株均不产磷氮霉素，对番茄灰霉病菌无抑菌活性。RT-PCR测定了orf 5和nsdA突变株的相关生物合成基因表达情况，表明其生物合成调控机制极其复杂。纯化了orf 1和orf 5两个调控蛋白，正在进行EMSA实验对其调控的靶基因进行研究。通过同源重组将透明颤菌血红蛋白基因vhb整合到S.auratus sp.AGR0001中进行表达，提高了发酵液抗番茄灰霉病菌的活性。.通过研究确定了基因orf 5、 orf 15、 orf 42和nsdA参与了新磷氮霉素A的生物合成，orf 5和nsdA在磷氮霉素生物合成中起正调控作用，基本探明了影响新磷氮霉素A生物合成关键基因的功能。撰写论文一篇，申请国家发明专利一项，获得授权专利一项。项目实施为我们对产生菌进行遗传工程改造提供了依据，为开发新磷氮霉素A成为抗作物灰霉病菌的生物农药奠定了基础。