温敏型水凝胶生物支架负载Lingo-1 shRNA促进脊髓损伤修复的研究

脊髓损伤轴突再生的困难是由于损伤局部产生的髓鞘抑制因子抑制轴突再生。本课题组前期工作表明，温敏型水凝胶在大鼠脊髓损伤模型中具轴突生长的生物支架和局部递送负载药物的作用。基于髓鞘抑制因子是通过NR1/lingo-1/p75（or Troy）信号复合物介导的信号通路激活RhoA抑制轴突再生，而Lingo-1是该信号复合物发挥活性的基础，在该信号通路起关键作用。本研究拟采用Lingo-1 shRNA联合温敏型水凝胶生物支架及控释的策略，制作大鼠脊髓损伤模型，局部植入负载Lingo-1 shRNA水凝胶，利用RT-PCR和蛋白电泳检测Lingo-1及RhoA基因表达，通过BDA轴突示踪、免疫组化、透射电镜及TUNEL等检测轴突生长、髓鞘形成和神经元存活，并结合BBB评分观察功能恢复，以阐明shRNA干扰Lingo-1协同水凝胶促进脊髓损伤轴突再生的作用机制，为探索新的脊髓损伤修复途径提供科学依据。

LINGO-1是一种中枢神经系统的特有蛋白,只表达于中枢神经系统神经元和少突胶质细胞。研究证实它是髓磷脂相关抑制因子信号复合体（NgR1信号复合体）发挥作用的重要功能组分,其胞质区第591位氨基酸残基的磷酸化是NgR1信号复合体发挥活性的基础,在髓磷脂抑制因子阻滞轴突再生的信号通路中起着关键作用。LINGO-1的发现为改善脊髓损伤后的抑制环境促进轴突再生提供了新的途径,即通过靶向抑制LINGO-1基因表达,阻滞NgR1/p75/LINGO-1及其下游信号的传导而促进轴突生长。本课题成功构建慢病毒载体介导LINGO-1-shRNA拮抗LINGO-1基因，在建立全横断脊髓损伤动物模型成功后，即刻体内拟采用温敏型水凝胶负载LINGO-1-shRNA协同修复脊髓损伤,使慢病毒LINGO-1-shRNA被水凝胶包裹而定位植入作用于损伤局部, 达到在水凝胶植入同时局部维LINGO-1-shRNA慢病毒有效转染浓度的要求,持续释放,有效将siRNA传递到目标细胞内，转染细胞。研究应用温敏型水凝胶生物支架负载递送LINGO-1-shRNA促进脊髓损伤神经修复的可行性和优越性，探讨LINGO-1-shRNA对轴突再生的影响和机制。结 果:动物模型脊髓损伤后，局部注射温敏型水凝胶生物支架负载递送LINGO-1-shRNA能够显著改善脊髓损伤后运动功能和脊髓诱发电位的恢复。通过免疫荧光检测显示水凝胶负载LINGO-1-shRNA能够显著提高损伤局部靶细胞的有效转染，RT-PCR 和Westrnblot检测显示能够明显减少损伤区域组织细胞LINGO-1及RhoA的基因表达水平，TUNEL染色显示损伤后细胞的凋亡水平明显被抑制，组织学染色(Nissl染色和HE染色)检测显示神经元存活明显增多及脊髓空洞面积减小。透射电镜、免疫荧光和Westrnblot检测显示水凝胶负载LINGO-1-shRNA能够显著促进损伤区域轴突的再生以及神经通路的发生，进而修补脊髓空洞面积。该课题证明生物支架负载 RNA干扰沉默特定基因促进脊髓损伤神经修复的可行性和优越性,有望解决在活体内局部应用 RNA 干扰 LINGO-1基因表达而促进轴突再生修复的难题,为脊髓损伤修复提供新的方法与思路。