利用基因敲除小鼠模型探讨BAG5在帕金森病发病机制中的作用

BAG5（BCL2-associated athanogene 5）is the only member of BAG (Bcl-2 associated athanogene) which has several BAG domains and is conserved in evolution. It was reported that BAG5 might regulate several pathogenic genes of Parkinson’s disease (PD) in their physiological function process. There is still controversy in the role of BAG5 in the pathogenesis of PD. In our previous studies on cytological level, we found BAG5 can directly interact with PINK1 and BAG5 protein prolonged the half-lives of PINK1 by inhibiting the ubiquitination of PINK1. It’s still not clear whether BAG can regulate PINK1 stability in model organism. On the basis of our preliminary study, we will verify the BAG5 knock-out mouse (BAG5-/-) which we have already got in this study, and then study whether the dopaminergic neurons in this knock-out mouse are more susceptible to MPTP. We will investigate the influence of PINK1 stability on the BAG5 knock-out model, and then approach whether this influence will cause mitochondria dysfunction, autophagy dysfunction, and cell apoptosis which are lethal to dopaminergic neurons. The main objective of this study is to further study the role of PINK1 stability regulated by BAG5 in the pathogenesy of Parkinson's disease.

BAG5（BCL2-associated athanogene 5）是BAG蛋白家族中唯一包含多个BAG结构域的蛋白，在进化上保守。目前研究表明BAG5可能参与调控多个帕金森病致病基因的生理功能，其在PD发病机制中的作用仍存在争议。本研究组前期在细胞学水平上研究发现PINK1和BAG5存在直接相互作用，BAG5可通过减少PINK1的泛素化水平，延长PINK1的降解半衰期，起到稳定PINK1的作用。但在模式生物上BAG5是否存在对PINK1的调控作用仍不清楚。本研究拟在前期研究基础上，对已获得的BAG5基因敲除小鼠模型进行鉴定，明确BAG5敲除小鼠中多巴胺能神经元是否对MPTP更易感，在此基础上探讨BAG5基因敲除对PINK1蛋白稳定性的影响，进一步探讨这种影响对多巴胺能神经元细胞线粒体功能、自噬及细胞凋亡的影响，深入探讨BAG5调控PINK1蛋白稳定性在帕金森病发病机制中的作用。

BAG5参与多个PD致病基因的生理功能，其在PD发病机制中的作用仍存在争议。前期本研究小组发现在细胞水平上BAG5和PINK1存在直接相互作用，BAG5蛋白可通过减少PINK1的泛素化水平，提高PINK1蛋白的稳定性，减少MPP+或鱼藤酮诱导的细胞线粒体损伤，在PINK1相关的PD发病机制中起着保护作用。为在小鼠模型中进一步探讨BAG5对PINK1的调控作用，本项目利用CRISPR/Cas9打靶技术成功构建了BAG5基因敲除小鼠模型，并在DNA、RNA和蛋白水平上获得证实，行为学检测未发现各年龄段小鼠出现帕金森样表现，并发现BAG5基因敲除未使小鼠多巴胺能神经元对MPTP更易感。通过Western Blot和RNAseq检测小鼠中脑蛋白表达水平，发现PINK1基因敲除模型中BAG5蛋白反馈性上调，而BAG5敲除模型中PINK1、Parkin蛋白表达水平无差异。在细胞水平上，BAG5在CCCP诱导的细胞凋亡中无明显影响，也不参与Parkin蛋白相关的线粒体自噬。利用基因芯片技术对BAG5敲除小鼠模型黑质基因表达谱分析发现，Rap1信号通路、钙离子信号通路、肿瘤相关信号通路、MAPK信号通路等通路的表达存在异常，凋亡和自噬等相关基因表达无差异，提示BAG5敲除并不通过影响多巴胺神经元的凋亡和自噬。以上结果提示在小鼠模型中，BAG5基因敲除不影响PINK1蛋白稳定性和多巴胺能神经元细胞线粒体功能、自噬及细胞凋亡，对PD的发病无明显影响。在BAG5敲除小鼠繁育过程中发现，雄性纯合小鼠完全不育，进一步研究发现，敲除BAG5基因并不影响减数分裂的正常进行，可导致小鼠精子头部丢失，提示BAG5参与精子变形过程，为男性不育症的研究提供了新思路。