奶牛血液嗜中性粒细胞DNA甲基化模式在乳腺炎感染过程中的作用

Escherichia coli are the common cause of leading to bovine mastitis. Neutrophils (PMN) are the first effectors of the inflammatory response. Recent studies have shown that PMN DNA methylation plays a key role in the regulation of human disease susceptibility. Our questions are whether the DNA methylation patterns of bovine PMN are differences between in the healthy cows and mastitis cows, whether the variation in DNA methylation patterns affect the infection process of cow mastitis, what is the regulatory mechanism? Based on the above questions, in the present study, firstly we are going to sequenced the blood neutrophils of healthy and Escherichia coli infected mastitis half-sib cows using the RNA-seq and Reduced Representation Bisulfite Sequencing methods; we do the joint analysis of transcriptome and methylation data, select the target genes associated with immune and inflammation; and then by the bisulfite sequencing and Real-time PCR, we detect the methylation levels and expression levels of genes in the samples, screen the methylation sites of regulation gene expression; by the use of mammary epithelial cells and neutrophils, we build the inflammatory cells model and study the key regulatory mechanism of gene methylation; finally, we analyze the effect of target gene methylation sites in population level. We would excavate the epigenetic markers associated with cow mastitis inflammation basing on the genome-wide DNA methylation dataset. The findings would provide insights into the molecular mechanism of DNA methylation in mastitis infection process and new targets for breeding and treatment of mastitis.

大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎发生的常见病因。嗜中性粒细胞（PMN）是炎症反应的第一效应者。研究表明PMN的DNA甲基化调控在人类疾病易感性中发挥关键作用。健康和乳腺炎牛PMN中DNA甲基化模式存在怎样的差异，它们是否影响乳腺炎感染过程中相关基因的表达，调控机制如何？鉴于此，本课题对健康和大肠杆菌乳腺炎半同胞牛血液PMN进行RNA-seq和简化甲基化测序；整合转录组和甲基化数据，筛选与炎症/免疫相关的基因；通过亚硫酸盐测序和实时荧光定量PCR验证基因甲基化水平和表达，鉴定调控基因表达的甲基化位点；构建乳腺上皮细胞和嗜中性粒细胞炎症模型，研究关键基因的甲基化调控机制；分析目标基因关键甲基化位点的群体效应，以期挖掘出与奶牛乳腺炎症反应相关的表观遗传学标记，揭示DNA甲基化在乳腺炎感染过程中发挥作用的分子基础，为奶牛乳腺炎的育种和治疗提供新的靶点。

奶牛乳腺炎主要是由病原菌引起的一种炎症反应，大肠杆菌是导致乳腺炎发生的常见细菌之一。嗜中性粒细胞是炎症反应的第一效应者，可抵御病原菌侵袭。细菌侵入乳腺后，嗜中性粒细胞被招募且快速迁移至炎症部位吞噬细菌清除病原。DNA甲基化在炎症的发生、发展过程中发挥调控作用，并且与疾病易感性密切相关。本研究以半同胞健康和大肠杆菌乳腺炎奶牛为模型，对血液嗜中性粒细胞进行DNA甲基化和RNA-seq测序，共检测到494个差异甲基化区域，1339个差异表达基因。对甲基化和转录组数据进行相关性分析，鉴定出两组数据中共有基因29个，其中7个基因启动子区甲基化和表达水平负相关，11个基因外显子区域存在差异甲基化。根据上述分析，筛选出CITED2、SLC40A1、LGR4、IL6R基因进一步实验验证。利用亚硫酸盐测序对CITED2和SLC40A1基因启动子的甲基化进行分析，两组甲基化率显著不同，健康组（HC组）CITED2和SLC40A1基因甲基化水平显著高于乳腺炎组（MC组），表达水平健康组显著低于乳腺炎组，表明CITED2和SLC40A1基因启动子的甲基化影响基因的差异表达，从而在大肠杆菌乳腺炎感染过程中发挥重要作用。在LGR4和IL6R基因可变剪切外显子区域发现存在CpG岛，LGR4和IL6R基因甲基化水平和相对外显子包含水平在健康牛与乳腺炎牛中存在差异，表明LGR4和IL6R基因外显区域的差异甲基化调控基因可变剪接外显子的剪切。综上，项目研究了大肠杆菌乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞DNA甲基化和基因表达模式变化，分析了位于基因不同区域的DNA甲基化位点调控基因表达的分子机制，挖掘出在大肠杆菌乳腺炎中发挥作用的关键基因，为奶牛大肠杆菌乳腺炎的表观遗传标记研究及应用提供了理论依据。