木质素单体合成中酶蛋白相互作用研究

Lignin is crucial for the adaptation of plants to the terrestrial biosphere, and constitutes a significant portion of the global carbon sink. Lignin provides hydrophobicity, resistance to biotic and abiotic stresses and compressive strength to the polysaccharide-protein matrix of the plant cell wall. Lignin is the primary recalcitrant component in the utilization of lignocellulosic biomass for biofuel, pulp and paper production and for digestion of forage in animal feed. Research on the monolignol biosynthetic enzymes is long-standing and extensive, but how these enzymes interact to regulate monolignol biosynthesis remains largely unknown. Our objective is to decipher the entire monolignol enzyme-enzyme interactome, and illustrate how these interactions regulate metabolic flux for monolignol biosynthesis. To do this, we propose a systematic analysis of all enzyme-enzyme interactions in the monolignol biosynthetic pathway, using bimolecular fluorescence complementation (BiFC), co-immunoprecipitation (co-IP), chemical cross-linking, blue-native immunoblotting (BN-PAGE), and enzyme assays. We will integrate this information to generate the most comprehensive monolignol enzyme-enzyme network ever undertaken, and infer the mechanistic regulatory roles of interactions on metabolic flux for monolignol biosynthesis. Understanding the monolignol interactome would guide strategies for more predictive genetic manipulation to improve plant productivity, production of materials, energy, and food.

木质素不仅是地球碳源组成的重要成分,也是植物适应生物圈的关键。木质素为植物细胞壁的多糖蛋白基质提供了抗压能力和疏水性, 并使其可以抵抗自然界中生物以及非生物的威胁。然而,由于木质素难以降解的复杂结构,生产生物质能源需要巨大的成本以及资源浪费。参与木质素单体合成的酶蛋白已经被广泛研究, 但是针对这些酶蛋白怎样通过互作来调控木质素单体合成的研究却是极为稀少。本项目希望通过解析毛果杨整个木质素单体合成途径中酶蛋白之间的互作，并进一步揭示出这些互作如何通过调节代谢通量来控制木质素单体合成的机理。为了达到该研究目标，我们利用双分子荧光互补实验、蛋白质免疫共沉淀、化学交联分析、蓝绿温和胶及酶活性测定进行系统分析木质素单体合成中21种不同酶蛋白之间相互作用, 并进一步构建木质素单体合成酶的代谢调控网络并揭示其作用机理, 为林木遗传改良提供理论依据。

木质素为植物细胞壁的多糖蛋白基质提供了抗压能力和疏水性,并使其可以抵抗自然界中生物和非生物胁迫。参与木质素单体合成的酶蛋白已经被广泛研究，但是针对这些酶蛋白怎样通过互作来调控木质素单体合成的研究却是极为稀少。本课题对这些互作蛋白的异聚体和同聚体进行BiFC实验验证。实验共进行276个组合，这些组合囊括了23个木质素单体合成酶间所有可能的互作，确定出了139对蛋白存在稳定或瞬时互作现象，在此基础上我们构建了毛果杨木质素单体BiFC互作网络。我们又利用相同的原生质体转化体系进行了3质粒共转化，用莹光亚细胞定位对5个膜蛋白进行了互作定位实验，共验证了46对互作位置。这些互作均被定位在内质网膜上，这结果表明木质素单体的互作并没影响到膜蛋白的锚定功能，膜蛋的一些独特的催化活性可能是通过对其它蛋白的招募形成复合体来达到对木质发育过程的时空调控的。为进一步验证蛋白互作，我们进行了互作的免疫共沉淀实验，首先我们建立了23个木质素单体的重组蛋白表达载体，对重组蛋白的表达条件和镍亲合层析纯化方法进行了优化，获得了较纯净和足够量的重组蛋白，以重组蛋为诱饵蛋白在毛果杨木质部的总蛋白提取液中进行co-IP实验。我们对pull-down产物进行了全蛋白质组学分析，进一步确定了蛋白的互作，明确了毛果杨木质素单体生物合成过程中的独立性和与其它生物代谢通路的相关的节点蛋白，CCoAOMTs与其它代谢通路蛋白存在广泛的互作关系，是木质素代谢通路与其它代谢通路协同互作的结点，而其它的蛋白互作只局限于木质素单体合成酶，具有专一性和独立性，我们在MS的数据分析基础上建立了pull-down互作网络。为验证蛋白互作对酶活性的改变，我们对CAD1和CCR2蛋互作的酶活性进了液相色谱分析，证明两种蛋白的互作显著提高了CAD1对松柏醛的催化活性，而对芥子醛的催化活性没有改变。综合上述结果，本研究揭示了整个单体木质素代谢途径中所有酶蛋白的相互作用，建立了目前为止最全面的酶蛋白互作调控单体木质素生物合成的网络，明确了单体木质素生物合成路径的独立性与结点。项目资助发表SCI论文5篇，国际会议报告2篇，学术专著1部。培养硕士3名，博士1名，其中2名已经取得硕士学位，项目投入经费86万元，支出86万元，各项支出与预算相符。