基于转录组分析的裸仁美洲南瓜（Cucurbita pepo）种皮形成分子机制研究

Hull-less Cucurbita pepo is a rare type of variant in nature. In previous two projects research, we determined the mechanisms about histological anatomy,secondary metabolites of lignin and carbohydrates synthesis in seed coat development of hull-less Cucurbita pepo, and preliminary revealed that PAL and CCR gene play a significant role in seed coat formation. In present research, the inbred lines of hulled Cucurbita pepo and hull-less Cucurbita pepo will be selected as experiment materials. The transcriptome sequence of seed coat at different development stages will be sequenced through RNA-Seq based on HiSeq 4000,and the protein -coding genes differentially expressed will be screened and will be entered into Gene Ontology(GO) and KEGG pathway analysis.The genes of expression differences more than 200 times between hulled and hull-less pumpkin will be verified through the qRT-PCR. Furthermore, the differentially expressed genes in the key signaling pathway of seed coat development wiil be selected and their expression characteristics in different seed coat developmental stages well be detected. Meanwhile, the key genes of seed coat development will be cloned by RT-PCR and RACE, plant expression vector with strong type promoter and RNAi will be constructed and transformed to cucumber (Cucumis sativus) to verify it function. Finally, the molecular mechanism of the seed coat formation will be revealed by the interaction analysis of gene network.The results of this research play a significant role in enriching seed coattranscriptome information of Cucurbita pepo and improving the naked pumpkin seed germplasm innovation in the future.

裸仁美洲南瓜（Cucurbita pepo）是自然界罕见的一种变异类型。前期从组织学、次生物质代谢层次明确了其种皮发育机理并初步揭示了PAL和CCR 基因在种皮形成过程中具有重要作用。但是，对其形成的分子机理仍不清楚。本研究拟以有壳和裸仁美洲南瓜高代自交姊妹系为试材，基于HiSeq4000平台，进行RNA-Seq，建立美洲南瓜种皮转录组数据库，筛选出不同材料种皮发育同一时期表达差异显著的蛋白编码基因，对其进行GO和KEGG通路富集分析，并对差异大于200倍的基因进行qRT-PCR验证，进而选择种皮形成关键信号通路上的差异基因，检测其在种皮不同发育时期的表达特征，同时，克隆种皮合成关键基因，构建强组成型启动子驱动的植物表达载体和RNAi载体转化黄瓜进行功能验证，最后结合基因网络互作分析，揭示裸仁美洲南瓜种皮形成分子机制。研究结果对于丰富美洲南瓜转录组信息、提升裸仁南瓜种质创新能力具有重要意义

裸仁美洲南瓜（Cucurbita pepo）是自然界罕见的一种变异类型。前期从组织学、次生物质代谢层次明确了其种皮发育机理并初步揭示了PAL和CCR 基因在种皮形成过程中具有重要作用。但是，对其形成的分子机理仍不清楚。本研究以有壳美洲南瓜和裸仁美洲南瓜的栽培种为实验材料，对各生育时期的美洲南瓜种皮及组织进行了各项生理指标测定，利用转录组测序技术建立了美洲南瓜转录组数据库，并且对2099个有壳美洲南瓜差异基因和1831个裸仁美洲南瓜差异基因进行了KEGG和GO富集，同时对差异基因进行转录因子分析。根据基因表达量的差异，筛选出了在种皮形成过程中具有显著差异的MYB转录因子家族。根据功能聚类分析及差异显著性筛选出了MYB转录因子家族中TRF1和MYB52基因。利用RACE方法克隆了与种皮发育及木质素合成相关的CpMYB-TRF1和CpMYB52的全长序列，并对美洲南瓜TRF1和MYB52进行基因特征及系统进化分析，发现该基因在不同品种美洲南瓜中并未发生突变。利用实时定量PCR分析了美洲南瓜不同发育时期及不同组织部位TRF1和MYB52的表达模式，同时，分析测定了美洲南瓜各部位中木质素合成相关酶活性和中间代谢产物的含量。为美洲南瓜TRF1和MYB52的编码序列构建了含有CaMV35S强启动子的PCAMBIA2300-TRF1-GFP和PCAMBIA2300-MYB52-GFP植物过表达载体，并使用组织培养法将过表达载体转化至烟草，明确了TRF1和MYB52在植物发育过程中的功能，初步揭示了裸仁美洲南瓜种皮形成分子机制。研究结果对于丰富美洲南瓜转录组信息、提升裸仁南瓜种质创新能力具有重要意义。