丽鱼三代虫分泌蛋白EF-1α的免疫功能研究

Gyrodactylids are common pathogens in aquaculture and have caused huge mortality in cultured fishes. There have been no such reports on studies or applications of preventative vaccine. A secretary protein, elongation factor-1 alpha (GcEF-lα), was isolated and identified from Gyrodactylus cichlidarum parasitizing on Nile tilapia. It is an important protein of the parasite. This project is aimed to study the functions of this protein in the parasitization and hosts immunoresistance. The main contents will include: 1) to reveal coding gene and protein characters of GcEF-lα, and construct an efficient prokaryotic expression system to obtain GcEF-lα recombinant protein; 2) to determine the functions of GcEF-lα in the infection process of G. cichlidarum, including the influence of GcEF-lα secretion or inhibition on the parasitizing of G. cichlidarum to the host Nile tilapia, and the influence of GcEF-lα stimulation on the immune cells of Nile tilapia in vitro; 3) to examine the immunologenicity of recombinational GcEF-lα, and the immune protection of this protein against G. cichlidarum infection in Nile tilapia; 4) to understand the physiological function and secretion regulation mechanism of GcEF-lα, which will be carried out by transcriptome analyses, tracing the expression dynamic of GcEF-lα gene in the course of G. cichlidarum parasitizing the host, and its relationship with the expression of relevant genes. These research results may have great importance to enhance our understanding to the infection mechanisms of Gyrodactylus infection, and further to provide theoretical references on the study of Gyrodactyloidea vaccine.

三代虫是养殖鱼类常见病原，可造成重大经济损失，迄今尚未有三代虫疫苗和应用研究的相关报道。本实验室鉴定获得寄生于尼罗罗非鱼的丽鱼三代虫的分泌蛋白EF-1α（GcEF-1α），这是一类在寄生过程中有重要作用的蛋白。本项目拟研究该蛋白在三代虫感染过程以及宿主免疫中的作用，主要包括：1）GcEF-1α的编码基因和蛋白特性，构建GcEF-1α的原核表达系统；2）GcEF-1α在感染过程中的作用，研究GcEF-1α分泌和抑制对丽鱼三代虫感染的影响，及离体情况下GcEF-1α对宿主免疫细胞的影响；3）重组GcEF-1α的免疫原性，及其对宿主感染丽鱼三代虫的免疫保护作用；4）丽鱼三代虫GcEF-1α基因在感染过程中的表达动态，以及与相关功能基因的关系，以揭示其生理功能及其分泌调节机理。研究结果将有助于揭示三代虫的感染机制，为三代虫的的疫苗研发提供重要的参考。

三代虫是养殖鱼类常见病原，可造成重大经济损失，迄今尚未有三代虫疫苗研究的相关报道。本项目研究1）丽鱼三代虫感染引起的尼罗罗非鱼粘膜组织获得性免疫应答；2）丽鱼三代虫分泌蛋白 GcEF-1α的编码基因和蛋白特性；3）重组蛋白rGcEF-1α的免疫功能，包括rGcEF-1α的免疫原性及其对尼罗罗非鱼感染丽鱼三代虫的免疫保护作用。从感染动态、免疫相关基因表达及特异性抗体三个层面，确证了丽鱼三代虫感染会引起尼罗罗非鱼皮肤粘膜组织的获得性免疫应答，进一步说明研发丽鱼三代虫疫苗的可行性。获得了GcEF-1α的全长CDS序列，为1380bp，编码459个氨基酸，理论相对分子质量为50.4 kDa。生物信息学方法分析发现GcEF-1α不含信号肽，属于G蛋白家族，具有典型的GTPase结构。构建原核表达载体，成功对GcEF-1α进行了原核表达和纯化。研究了rGcEF-1α的免疫原性，发现添加佐剂ISA 736A VG后rGcEF-1α可在腹腔注射后第14天引起尼罗罗非鱼粘液中特异抗体IgT含量显著上升，同时在第7天引起血清中特异抗体IgM含量上升，但无显著性差异。rGcEF-1α和rGcEF-1α+ISA 763A VG腹腔注射还会引起脾脏组织中与获得性免疫记忆相关的基因MHC Ⅱβ、IgM、CD4、IgT和pIgR的上调表达。评估了腹腔注射和浸泡rGcEF-1α对尼罗罗非鱼感染丽鱼三代虫的免疫保护作用，发现20.0 μg/鱼的rGcEF-1α腹腔注射后丽鱼三代虫的感染在第4、6和第8天显著低于PBS对照组，10.0 μg/鱼注射组在第8天显著低于PBS对照组；2.5 μg/mL和5.0 μg/ml rGcEF-1α浸泡后丽鱼三代虫的感染峰值均低于PBS和BSA对照组。研究结果可为丽鱼三代虫的疫苗防治提供一定的理论参考。