胸腺上皮细胞中异位基因表达的DNA甲基化调控机制研究

Medullary thymic epithelial cells(mTECs) express a large amount of tissue-restricted antigens (TRAs) by promiscuous gene expression(pGE). However, the epigenetic regulation mechanism of pGE is largely unknown. Two TRA genes (Casn2 and Gad67), which are expressed by over half of mTECs, are hypomethylated, while two liver TRAs (Fgg,Gstm3) are hypermethylated in the whole mTEC population, indicating DNA methylation status of TRA positive mTEC subpopulations could not be revealed from whole population analysis. Our previous research revealed, for the first time, the genome-wide DNA methylation profile of mTEC. We also found OPG which is a key molecule in the signaling pathway of mTEC development is regulated by DNA methylaion. In addition, using DNA methylation analysis of Aire, we identified a progenitor population of mTEC. In this research, we will isolate TRA(Fgg,Gstm3,Ptprn) positive mTEC subpopulations to analyze their DNA methylation levels, in order to show the DNA methylation regulation in a certain mTEC population that express a certain TRA. We will express Aire-GFP in mTEC, cTEC and MIN6 cell line to find the epigenetic marker of the recognition sites by Aire. We will also try to find the possible function of Aire and Dnmt3L in pGE in mTEC. This research will help to understand the coordinate function of epigenetic regulation and transcription factor of pGE in mTECs, which is of great importance in establishing central tolerance.

胸腺髓质上皮细胞(mTECs)以异位基因表达的方式表达组织限制性抗原(TRA)，其表观遗传调控机制并不清楚。已知mTEC细胞群体中过半数细胞表达的TRA (Casn2，Gad67)为低甲基化状态，但mTEC亚群中表达的TRA(Fgg,Gstm3) 为高甲基化状态，因此异位基因表达是否在高甲基化状态下可以进行值得探讨。我们前期工作首次揭示了mTEC的全基因组DNA甲基化图谱，发现DNA甲基化调控mTEC发育信号途径中OPG的表达，利用Aire的甲基化水平鉴别出了mTEC的前驱细胞。本研究将分离mTEC中TRA基因阳性亚群对其DNA甲基化水平进行分析以揭示TRA异位基因表达的调控模式；通过在mTEC，cTEC和MIN6细胞系中表达Aire-GPF对Aire的表观遗传识别标志进行检验；并对mTEC中Aire与Dnmt3L的相互关系进行初步探索，为中枢免疫耐受的表观遗传调控机理提供理论依据。

胸腺中的基质细胞主要是皮质胸腺上皮细胞(cTEC),髓质胸腺上皮细胞(mTEC)，成纤维细胞，和内皮细胞。加上胸腺中的树突状细胞和巨噬细胞，共同构成胸腺微环境，对形成功能性T细胞库起着重要的作用。其中mTEC以异位基因表达的方式，表达数千种的组织特异性基因，对T细胞的阴性选择起着重要的作用。mTEC中已知Aire与Fezf2是两种重要的调控因子。在本项研究中，根据前期实验结果，在小鼠胸腺中对Aire基因相邻的Dnmt3L基因的表达进行了研究，发现Aire并没有与Dnmt3L有着表达上的相关性，提示Dnmt3L与Aire互作的可能性比较小。我们对mTECs中Aire依赖型表达的Fgg，Ptprn，Tpo三种组织特异性基因的阳性亚群进行筛选，但是由于阳性细胞群数量数目太少，远远低于我们的分析临界值我们无法获取阳性亚群的DNA甲基化调控信息。我们的实验表明，明确胸腺基质细胞亚群的基因表达特征，是分析其表观遗传调控的前提与必要条件。因此我们及时调整实验方案，对野生型和Aire敲除型小鼠的CD45-MHCII+EpCAM+细胞群进行了单细胞转录组测序研究。我们发现功能性Aire的缺失导致MHCIIhi mTEC比例增多，而MHCIIlo mTEC比例没有发生变化，其他亚群的变化也取得了初步的结果。我们对以Fgg，Ptprn，Tpo为代表的组织特异性基因的阳性亚群的变化规律也进行了研究。目前本项研究还在进行中，我们将在TEC细胞株获得之后把原计划的Aire对pGE表观遗传调控的实验继续进行，为进一步了解mTEC中异位基因表达及表观遗传调控规律提供重要实验基础。