益肾通脉方药对腺嘌呤法大鼠不育症睾丸支持细胞紧密连接的动力学调控

Infertility is the global issue of impacting families, and the global incidence of infertility is 5% to 35%, 50% of infertility is related to male reproductive shortcomings . Most doctors think male hormones secretion and spermatogenic cell utilization efficiency are the import factors of infernity , however, the blood-testis barrier plays a great roll in the process of infernity which has a function to support the tight junctions between cells based on the formation of structure in the seminiferous epithelium and provide a stable micro-environment and a unique immune barrier. Based on improvements of male infertility by Yi Shen Tongmai prescription ,the aim of this project is to observe the animal Sertoli cell tight junction structure of membrane proteins (seminiferous epithelial tissue blocking proteins, claudins, JAMs, Zos) and the expression and its impact closely connection dynamics factor (tintracellular Ca2 + concentration, TGF-β3mRNA changes of Ca2 +-ATPase mRNA expression of PKA) and to explore the mechanism of Yi Shen Tongmai prescription to improve the dynamics balance of Sertoli cells in male infertility animals, by electron microscopy, immunohistochemistry, cell culture, serum pharmacology and molecular biology in vivo and in vitro experiments ,

不生育全球发病率在5%~35%，其中50%与男性的生育缺欠有关，血睾屏障是生精上皮中以支持细胞间的紧密连接为基础形成的结构 ,为生精提供了稳定的微环境和独特的免疫屏障，有序的开放机制保证了精子发生的顺利完成。.本课题在以往对肾阳虚大鼠不育症动物模型改进及益肾通脉方药治疗男性不育症临床观察、药效学研究已取得较为肯定的疗效基础上，采用电镜、免疫组化、细胞培养、血清药理及分子生物学技术，通过在体和离体实验，观察动物睾丸支持细胞紧密连接相关结构膜蛋白（生精上皮组织闭锁蛋白、claudins、JAMs、Zos）的表达及其影响紧密连接动力学的相关因子（支持细胞内 Ca2+浓度的变化，TGF-β3mRNA、Ca2+-ATP酶mRNA、PKA的表达）的变化，探讨肾阳虚不育症模型睾丸支持细胞紧密连结动力学平衡的失控对雄性动物生育的影响，进而阐述益肾通脉方药治疗不育症的原理。

研究内容及目标：.⒈观察腺嘌呤法大鼠不育症动物模型睾丸支持细胞紧密连接状态的变化.⒉观察益气通脉方药对腺嘌呤法大鼠不育症动物模型睾丸支持细胞紧密连接动力学平衡的调控，从细胞分子水平探讨益气通脉法治疗男性不育症的机理。在原设计的基础上对各组大鼠相关紧密连接调节因子的变化进行了研究，免疫组化技术观察了TGF-β3的表达，RT-PCR技术检测了TGF-β3mRNA、Ca2+-ATP酶mRNA、PKA mRNA表达情况。.⒊分离纯化并培养大鼠睾丸支持细胞，利用血清药理学方法，观察益气通脉方药对细胞胞内信号传导通路主要元件的影响，从细胞学-分子生物学-信号传导多层次证实益肾通脉方药重建睾丸支持细胞紧密连接的动力学平衡的分子机制。.重要成果：.离体及在体实验表明，将腺嘌呤按500mg/ml 浓度配制，按腺嘌呤1∶10比例加入阿拉伯胶作为助溶剂，1ml /(100g•d) 剂量灌胃，可以使1.5月龄大鼠睾丸支持细胞紧密连接动态平衡紊乱。其中调节因子TGF-β3及其mRNA的表达上调、Ca2+-ATP酶mRNA、PKA mRNA表达下调，进而使其结构蛋白（claudin、Occlaudin、JAMs）及周围膜蛋白（ZDs）下调，而益肾通脉方药益精方能够起到拮抗之效，为中药复方治疗男性不育症提供实验基础。.科学意义：.男性生育的关键是获得足够的健康精子，精子的产生需要睾丸间质细胞产生足够的睾酮，并富集至生精上皮，以促进精原干细胞分化进而生成精子。中药复方治疗男性不育症的相关研究多从睾丸间质细胞、生精细胞角度展开研究。然而，血睾屏障是上述生理过程的保障，睾丸支持细胞紧密连接的动态平衡是血睾屏障发挥作用的关键。因此，中药复方通过调控睾丸支持细胞紧密连接的动态平衡，进而修复血睾屏障的损伤，改善男性的修复功能的研究鲜见报道，具有重大科学意义。