1.1类新药硝克柳胺通过干扰AGE-RAGE信号通路对慢性肾功能不全的治疗作用机制研究

Advanced glycation end products (AGEs) interacting with its receptor (RAGE) plays an important role in the pathogenesis of chronic renal dysfunction, which could be caused by diabetic nephropathy, hypertension and so on. Activation of AGE-RAGE signal pathway can stimulate the expressions of fibrogenic transforming growth factor (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF), which in turn induce renal hypertrophy, sclerosis and functional failure. Nicousamide, a novel class 1.1 medicine and a coumarin-aspirin derivative was demonstrated to inhibit AGEs formation and crosslink and prevent diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats, which is now undergoing Phase- Ⅱ clinical evaluation. However, the detailed mechanism about how this small molecular compound interferes the AGE-RAGE pathway is not clear. This project aims to use surface plasmon resonance(SPR) technique to analyze the interaction between nicousamide and glucose, proteins and AGEs, try to understand how nicousamide inhibits the AGEs formation and block the AGEs-protein crosslink. Meanwhile, we will investigate whether nicousamide can inhibit expression of receptor of AGEs and inactivate RAGE's activity. One in all, this project will help us to understand further pharmacological mechanism of nicousamide.

晚期糖基化产物（AGE）通过和其受体（RAGE）结合、激发下游信号通路是引发包括糖尿病肾病在内多种慢性肾功能不全的主要原因之一。我所自主研发的1.1 类新药硝克柳胺，临床前药效学研究已经证实它对于多种慢性肾病有着良好疗效，目前该药正在申报Ⅱ期临床试验。前期研究表明硝克柳胺能够有效抑制由AGE 引起的大鼠外周血和肾组织中TGFβ1 和结缔组织生长因子（CTGF)的分泌，但是对于硝克柳胺是否直接作用于AGE-RAGE信号通路，尚缺乏充足的研究证据。本课题目的在于借助体内、体外模型研究硝克柳胺是否可以抑制肾损伤状态下RAGE在足细胞、肾小球内皮细胞和间质细胞中的表达，能否抑制AGE-RAGE激活后引发的下游炎症和氧化应激反应、对足细胞是否有保护作用。同时利用先进的表面等离子共振技术（SPR），研究硝克柳胺是否与RAGE存在直接相互作用，旨在进一步深入阐明1.1类新药硝克柳胺的肾保护作用分子机理。

本项目核心目的是研究我们医科院药物研究所拥有自主知识产权的1.1类新药硝克柳胺通过干扰AGE-RAGE信号通路对慢性肾功能不全的治疗作用机制研究。我们前期的研究结果显示硝克柳胺能够显著改善糖尿病肾病大鼠的蛋白尿，但是其具体作用机理不详。本研究旨在再次构建糖尿病肾病大鼠模型，着重研究硝克柳胺对大鼠肾脏足细胞的保护作用，同时研究硝克柳胺对足细胞保护作用的机制。对于分子药理机制，主要集中在AGE-RAGE信号通路和纤维化相关的TGFβ-smad信号通路。研究结果发现，硝克柳胺能够显著改善大鼠肾病末期的纤维化程度，降低蛋白尿。Real-time PCR和免疫荧光都证实，硝克柳胺能够显著显著增加足细胞标志物nephrin, podocin和CD2AP的表达，稳定了足细胞的结构，使蛋白不容易滤出。我们提取动物大鼠肾脏，western blot证实，硝克柳胺可以显著降低促纤维化因子TGFβ1的表达，抑制TGFβII型受体的磷酸化，同时我们通过promega公司的ADP-GLO的激酶试剂盒，详细研究证实硝克柳胺通过非ATP竞争性的方式抑制了TGFβII型受体对下游激酶的磷酸化。另外，实验证实硝克柳胺可以显著抑制AGE刺激的下游的肾脏系膜细胞分泌促纤维化因子，如TGFβ1， fibronectin等，但是对其受体RAGE的mRNA和蛋白水平影响不大。表面等离子共振(surface Plasmon resonance, SPR) 技术研究证实，硝克柳胺可以直接作用于RAGE蛋白，与该蛋白有比较明显的结合效率，Kd在μM水平，提示，硝克柳胺有可能通过直接结合与RAGE蛋白，从而抑制了AGE-RAGE信号通路的激活，减缓了下游促纤维化，破坏足细胞结构的一系列结构效果。但是SPR同时显示，硝克柳胺同TGFβRII受体的激酶活性部位没有显著的结合，提示硝克柳胺抑制TGFβRII磷酸化是通过非酶活性中心，其具体的蛋白结合位点，有待进一步研究。本项目最终明确了1.1类新药硝克柳胺对于足细胞的保护作用和部分阐明了其机制，为这个药的后续开发和其后续的结构优化提供了帮助。