基于快速膜电位感受器的视网膜电刺激研究

Outer retinal degeneration is one of the most intractable eye diseases, affecting millions of patients worldwide. Degenerated photoreceptors impair the ability of retina to detect light but the inner retinal neurons remain largely functional. By directly stimulating the remaining inner retinal neurons, bioelectronic retinal prostheses have been demonstrated to partially restore vision in patients blinded by retinitis pigmentosa (RP). Optimization of the stimulation parameters is of significant clinical value in the improvement the patients’ visual ability. Presently, research on the stimulation strategy typically relies on multi-electrode array (MEA) recording and calcium imaging to report the retinal neural activity under electrical stimulation. However, due to limited spatiotemporal resolution, these experimental techniques cannot fully address many critical questions in the retinal response to electrical stimuli and sometimes produce conflicting results. Hereby, we propose to employ a novel class of ultrafast fluorescent membrane voltage indicator to establish a new reporter of the retinal neural activity that is superior in spatiotemporal resolution. By monitoring changes in the fluorescence, we will study sensitivity and spatial resolution of the retinal response under various stimulation parameters. Overall, the proposed project will build a significantly improved retinal signal acquisition tool to advance our understanding of the electrically-evoked visual responses and thereby offer experimental basis for the optimization of the electrical stimulation of retina.

视网膜退行性疾病是目前最难治疗的致盲性疾病之一，严重影响了患者及其家庭的正常生活。该类疾病通常表现为光感受器损伤而下游视网膜内层神经保持了相对完整的功能性。植入式电子视网膜假体通过对视网膜内层神经直接给予电刺激可以部分地恢复失明患者的视力。电子视网膜假体电刺激参数的优化，对于恢复及提高病人视觉能力尤为重要。基于动物模型的视网膜神经活动观测方法主要有MEA多电极记录和钙离子成像技术，但两者均难以满足对视觉系统神经发放的高分辨率、高灵敏度的记录要求，甚至产生了某些不一致的实验结果。针对这些技术手段的限制，本项目拟采用新型动作电位成像技术，通过快速荧光膜电位感受器在视网膜中的表达，结合对电极指标和刺激参数的改变，研究不同参数组合下视网膜的反应敏感度和空间分辨率。本项目将极大改善目前已有的研究方法，为电子视网膜假体的参数优化提供重要实验依据，同时进一步推进我们对视网膜电信号处理的认识。

背景.对人工视网膜而言，优化电刺激方案是发挥其临床价值的关键步骤。 先前研究表明，将电刺激的脉冲宽度增至~25ms，可以显著提高电刺激的空间分辨率。然而，增加刺激脉冲时长是否会提高损伤视网膜风险，尚未有系统研究。同时，超声（US）可可用作非侵入性神经调节工具，我们希望能研发声学视网膜假体（ARPs）。.方法.通过多电极阵列（MEA），我们对来自野生型小鼠和视网膜光感受器病变小鼠的离体视网膜施加了双相电刺激脉冲，记录其动作电位发放，并进行波形分选。在两个固定的刺激脉宽（1ms和25ms）下，对每个RGC记录单元，我们绘制了动作电位频率-刺激幅度曲线，并从中提取了三个参数：阈值，安全极限值和刺激范围。我们还研究了大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）在2.25 MHz下对低频聚焦US刺激（LFUS）的反应能力，并通过进行体外多电极阵列记录来表征US反应的神经生理特性.结果.在单电极刺激实验中，我们发现，平均85%的RGC记录单元，在极端刺激强度下，出现了反应减弱现象；和1ms脉宽电刺激相比，25ms脉宽电刺激显著降低了RGC记录单元的安全极限值和刺激范围。在提升电刺激幅度过程中，25ms脉宽电刺激至多能维持平均51%的RGC记录单元处于健康状态，而1ms脉宽电刺激至多可维持平均76%的RGC记录单元处于健康状态。我们还观察到，LFUS可以可靠地激活RGC；RGC的时间响应特性，包括其潜伏期，发射速率和响应类型，可通过声强来调节。.结论.在基于对生物安全性指标（由电刺激诱导的RGC动作电位发放）进行测量的基础上，我们认为，长脉宽电刺激可造成RGC反应衰减，这提示了在此条件下审慎设定电刺激强度的重要性。此外，我们的超声刺激实验表明LFUS存在暂时的神经调节作用，并有可能为ARP的发展打开新的途径。