基于核酸适体识别的免标记免固定化电位型传感器检测海水中致病菌

本项目将首次系统研究基于核酸适体识别的免标记免固定化电位型生物传感器检测海水中致病菌污染物，深入探讨以核酸适体作为识别分子实现对不同致病菌的高选择性识别以及采用聚阳离子作为指示离子实现均相电极电位信号高灵敏传导的检测机制。通过考察核酸适体与靶致病菌相互作用的动力学过程，筛选适合的核酸适体，实现对致病菌的特异性识别；采用电流驱动法将电极内充液中的聚阳指示离子释放到聚合物膜离子选择性电极表面，用以电位传导由靶致病菌导致的核酸适体构型的变化；通过优化聚合物电极膜的组分、电极内充液浓度、施加电流大小和电流时间长短实现指示离子可控释放，进而调节电极的灵敏度和检测范围；采用样品在线快速过滤法，有效消除海水基体效应，提高检测灵敏度，首次开发出一类检测海水致病菌的免标记免固定化新型传感器。在提高对海水致病菌特异性识别和快速、灵敏检测等方面具有重要的理论和方法创新，为满足国家在水环境监测领域的需求做出贡献。

海水致病菌污染不仅威胁大众的健康安全，而且会对水产养殖业带来巨大的危害。因此，亟需发展快速、准确、高灵敏响应的传感器技术，用于监测海水致病菌污染物。.本研究采用核酸适体作为识别元件，实现对致病菌的高选择性识别；采用聚阳离子鱼精蛋白作为指示离子，实现电极电位信号的高灵敏传导。据此，发展了检测海水致病菌的免标记、免固定化电位型传感器新技术。项目筛选、设计、合成了部分陆源致病菌及海洋自身细菌的核酸适体，考察了鱼精蛋白与核酸适体的相互作用，模拟了核酸适体与目标物的相互作用；测试了聚离子敏感膜电极电位响应特性，探讨了免标记、免固定化核酸适体电位传感新原理；研究了指示离子可控释放技术，发展了基于电流调控聚阳离子可控释放的计时电位分析技术；结合流动注射技术，进一步发展了致病菌连续、快速检测的核酸适体电位分析法；制备了DNA纳米结构功能化磁珠，实现了对靶致病菌的快速分离与富集，采用DNA自组装技术，发展了高灵敏的电位分析新方法；采用滤膜在线过滤技术，有效消除了海水复杂基质的干扰。.采用免标记、免固定化核酸适体电位传感技术，实现了对单增李斯特菌的高灵敏、高选择性、快速检测，线性范围为10-500 CFU/mL，分析时间为40分钟，其它菌种如大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、绵羊李斯特菌等对测定不产生干扰；采用基于电流调控聚阳离子可控释放的计时电位流动注射分析技术，可以实现对大肠杆菌E. coli O157 的连续检测，线性范围为10-10^4 CFU/mL，本法具有节省核酸适体试剂用量、电极可以连续使用等优点；采用DNA纳米结构功能化磁珠，可以消除海水基体对测定的影响，并能够提高测定的灵敏度，结合固体接触式电极计时电位法，实现了对溶藻弧菌的高灵敏检测，线性范围为10-100 CFU/mL。.本项目发展的核酸适体电位传感技术具有一定的通用型，通过改变核酸适体的序列，能够实现对其它致病菌的高灵敏、高选择性、快速检测，为海水等复杂环境基质中致病菌等微生物的快速电化学检测提供了新的思路。.共发表SCI论文21篇，影响因子5.0以上14篇，7篇发表于《美国分析化学》杂志；获得发明专利授权1项，申请发明专利5项。培养博士生毕业生3名，硕士毕业生2名。项目组成员在国内外会议上做邀请/口头报告9次。以本项目研究成果为重要基础，研究团队获得2014年度山东省“自然科学二等奖”。