利用新方法筛选和验证神经干细胞分化的特异相关基因

近年来，表观遗传学（epigenetics）已成为生命科学中普遍关注的前沿学科。DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，也是近年来发现的一种新的生物标志物。本课题拟建立一种新的特异差异甲基化基因筛选技术- - -染色质免疫沉淀结合内部甲基化位点扩增（ChIP-AIMS）技术,利用我们已建立的神经干细胞(NSCs)体外诱导分化模型，采用ChIP-AIMS技术筛选，克隆、鉴定出细胞分化过程中特异相关的功能性差异甲基化的基因，分析其表观遗传调控可能机制;并应用高通量、高敏感、高特异性的甲基化荧光检测（Methylight）技术在其他诱导物诱导分化过程中分析这些差异甲基化的基因的甲基化模式和水平，从而初步验证并应用。本研究不仅为特异的甲基化标志物的发现提供一个新的技术手段，而且对NSCs分化表观遗传学机制阐明和NSCs分化的早期发现、诱导分化的靶位调控及干预均有重要的理论和实际意义。

本课题为筛选及验证神经干细胞分化（NSC）特异相关的甲基化基因,利用已建立的体外诱导NSC分化模型，通过免疫印迹法、免疫荧光、SssI甲基转移酶法、甲基化DNA 免疫沉淀法等方法，发现在NSC分化为神经细胞过程中整体基因组DNA甲基化水平逐渐降低，局部CpG岛高甲基化，揭示了表观遗传模式参与控制细胞发育表型。通过ChIP-AIMS方法筛选出二十余种维甲酸（RA）诱导NSC分化差异甲基化基因，其中重点研究了O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(MGMT)，并观察了分化中组蛋白修饰改变，利用MethyLight、亚硫酸氢盐测序法确定MGMT基因启动子CpG岛低甲基化，进一步利用RNA技术、免疫印迹等方法发现DNA甲基化酶DNMT1介导并与甲基化DNA结合蛋白共同维持MGMT基因启动子CpG岛低甲基化。此外，组蛋白修饰异常也介导了MGMT基因的表达。本研究为RA诱导NSC分化表观遗传机制的阐明提供了新的资料；同时亦对NSCs分化表观遗传学机制阐明和NSCs分化的早期发现、诱导分化的靶位调控及干预均有重要的理论和实际意义。同时我们亦观察到组蛋白去乙酰化转移酶（HDAC）抑制剂丙酮酸钠(VPA)对NSC诱导和抑制现象，并进一步分析了此过程与表观遗传学和信号通路的关系。结合体内亦探索了HDAC抑制剂能否逆转神经疾病的病理变化，提高学习记忆，并进一步研究表观遗传学的改变。再者我们亦发现MAPK通路在神经分化中具有显著变化并与表观遗传学存在交互作用，在体实验印证了AD模型鼠记忆改善存在MAPK蛋白表达变化，其机制也可能涉及表观遗传学机制。从而将表观遗传学机制与神经系统疾病相互联系，为基础和临床研究提供理论基础。