G蛋白偶联受体折叠过程中分子伴侣作用机制研究

G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate most of our physiological processes, and so have great potential as drug targets for a broad spectrum of diseases. GPCRs must fold to their native states to function in vivo. Study of the function mechanism of molecular chaperones in GPCRs folding is of great significance to understand their folding and functionalization. However, such studies in vivo are particularly challenging because of the complex environment of the cell. Herein an in vitro cell-free protein synthesis system will be employed. With the addition of different chaperones like heat shock proteins and chaperonins directly in this aqueous system, their function mechanisms in the folding of a model GPCR hCCR5 expressed therein will be systematically studied, including their effect on the folding kinetics of hCCR5 nascent chains, receptor structural stability and biological activity, and the interaction between chaperones and hCCR5 nascent chains. In addition, the results obtained will be compared with the biological activity, structural stability and refolding kinetics of wild-type hCCR5 to further deepen our understanding of chaperone-assisted GPCRs folding. Our study would facilitate a comprehensive grasp of the mechanism of GPCRs folding, and thus would be helpful in guiding a number of related biotechnologies such as recombinant expression of functional GPCRs and refolding of denatured GPCRs.

G蛋白偶联受体广泛参与调节体内各项生理过程，也是当前备受青睐的药物作用靶点。受体正确折叠是其发挥生物功能的先决条件，研究受体折叠过程中分子伴侣作用机制，以揭示其折叠和功能化规律，具有重要的科学意义。本项目基于前期工作基础，拟采用无细胞体外蛋白合成技术，重点研究模型受体hCCR5体外表达和折叠过程中分子伴侣的作用机制，该方法可有效克服体内研究所面临的细胞环境极其复杂、组成不均一等瓶颈因素。研究中将热激蛋白、伴侣素等不同分子伴侣直接加入到hCCR5的无细胞表达溶液中，系统考察它们对hCCR5新生肽链折叠动力学、结构稳定性和生物活性的影响，以及分子伴侣与hCCR5新生肽链的相互作用过程。同时将所得研究结果与野生型hCCR5的活性、结构稳定性和体外再折叠动力学进行比较分析，以加深对分子伴侣作用机制的认识。本研究将加深我们对G蛋白偶联受体折叠规律的认识，并为受体功能性表达、失活后复性等提供理论指导。

G蛋白偶联受体（GPCRs）正确折叠是其发挥生物功能的先决条件，对于GPCRs 折叠机制及关键因素的研究，既是揭示生命基本过程的必要手段，也势必对相关疾病的治疗产生深远影响。本项目采用无细胞体外蛋白合成技术，系统研究了模型受体hCCR5体外表达和折叠过程中分子伴侣GroEL-GroES的作用机制，该方法可有效克服体内研究所面临的细胞环境极其复杂、组成不均一等瓶颈因素。研究表明，GroEL-GroES可以极大地加速hCCR5新生肽链的折叠速率。而且加入GroEL-GroES后，无细胞合成的hCCR5结构稳定性也显著增强，对蛋白酶水解具有更高的抵抗性；hCCR5的配体结合活性也得到了提高。这都说明新生hCCR5肽链在GroEL-GroES辅助下进行了更有效折叠。同时研究发现，虽然单独GroEL能够起到部分辅助GPCRs折叠作用，但只有与GroES协同作用，才能最有效地发挥辅助折叠的功效。我们还用另一种GPCR受体hCXCR4对得到的CCR5与GroEL-GroES的作用模式进行了验证，得到了一致的作用规律。. 另一方面，采用跨膜螺旋模拟简化全长GPCRs的疏水残基片段，利用等温滴定量热和荧光各向异性技术对GroEL与GPCRs新生肽链的相互作用进行了研究，包括两者结合的热力学参数、具体结合位点和结合方式，以及GroES与ATP介导的解离过程等。研究表明，两者结合位点位于GroEL顶端域的螺旋H和I附近，而且GroEL的双环很可能采取交替循环的方式来结合与释放GPCRs。同时，GroES和ATP能够有效地促进GPCRs从GroEL腔内的解离释放。. 综合上述研究结果，我们推测并建立了GroEL-GroES辅助GPCRs折叠的机理模型。通过GroEL-GroES在细菌视紫红质BR复折叠中作用的对比研究，进一步验证了我们提出的机理模型。BR是GPCRs研究的模式蛋白，易于制备，相关生物化学信息丰富，也将是我们后序开展GroEL-GroES辅助GPCRs折叠单分子研究的主要对象之一。本项目所开展的系统研究工作，能够加深我们对GPCRs 等膜蛋白折叠机制及其功能化的认识和理解，促进蛋白质折叠的基础研究，并对GPCRs 的重组功能性表达、失活GPCRs复性、治疗因GPCRs 错误折叠造成的疾病、药物设计开发等产生积极作用。