御谷转录因子PgRAVs参与调控渗透胁迫的机理研究

Pearl millet is well-suited to grow in harsh conditions including drought, high temperature and high salinity. So taking the Pearl millet as the research object to explore resistant genes has great significance to cultivate new varieties. Our previous research demonstrated that PgRAVs was highly related to the drought-tolerance in Pearl millet. RAVs are a special family of plant transcription factors which contain both AP2 and B3 domain. However, there are many controversies over the expression pattern and gene function of RAVs. Therefore, six PgRAVs family members have selected for molecular and genetic analyses from Pearl millet genome in this project. Real-time PCR, subcellular localization, yeast one/two-hybrid system, transgenic and other techniques will be used to characterize and determine the biological function of PgRAVs. Meanwhile, promoter transformation, RNA-seq, a dual luciferase system, ChIP-PCR and other techniques will be applied to identify the molecular regulation network involved in osmotic stress with PgRAV3 as the node. All these results will not only provide theoretical and practical support for the development of new resistant varieties but also have positive effects on ensuring forage security and breeding of other cereals.

御谷是对干旱、高温、高盐等逆境抗性极强的牧草，以御谷为研究对象，发掘抗逆基因资源对抗性新品种的培育有重要的意义。我们前期的研究表明御谷的抗旱特性与转录因子RAVs密切相关。RAVs是植物转录因子家族中比较特殊的一族，包含2个结构域，AP2和B3。但目前对RAVs的表达模式及基因功能还存在较大的争议。为此，本研究从御谷基因组中调出6个PgRAVs转录因子家族成员，拟通过qPCR、亚细胞定位、酵母单杂/双杂、转基因等技术解析PgRAVs转录因子家族成员的生物学功能。同时，利用启动子转化研究、RNA-seq分析、双荧光素酶系统、ChIP-PCR等手段分析PgRAV3转录因子的上游信号分子、下游调控基因，明确以PgRAV3为节点的渗透胁迫分子调控网络。所有这些研究结果将为抗性新品种的培育提供理论基础和实践支持，同时对保障粮草安全和其他谷类植物的育种也有积极的作用。

御谷是禾本科一年生草本植物，是一种重要的粮食作物和饲料作物，此外还可用作生物能源。御谷极耐干旱，被认为是研究植物抗旱性的理想作物。本文克隆了御谷的RAVs（Related to ABI3/VP1）基因及其启动子，生物信息学分析表明，PgRAVs均具有AP2和B3两个保守结构域，氨基酸序列比对发现PgRAVs与玉米、小米、拟南芥、粳稻等的RAV氨基酸序列存在高度相似性，并与小米的遗传距离最近，说明御谷PgRAVs可能与小米的RAV功能具有很高的相似性。转录自激活活性分和亚细胞定位结果说明，PgRAVs定位在细胞核中，且没有转录自激活活性。PgRAVs基因启动子具有多个顺式作用元件，共有的激素响应元件包括脱落酸诱导元件（ABRE）和涉及茉莉酸甲酯反应的元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）。这说明PgRAVs启动子活性可能受到外源激素的影响。构建PgRAVs基因启动子的植物表达载体，对转基因植株的根、茎、叶、花进行GUS组织化学染色发现只有花染成蓝色，但PgRAVspro:GUS转基因植株在花中染色的部位及深浅具有差异，这说明PgRAVs启动子倾向于在生殖器官中表达，且在生殖器官中不同部位的表达水平也不同。构建PgRAVs基因的过表达载体，并通过叶盘法转化本氏烟草，发现PgRAVs转基因植株出现矮化情况。进一步研究发现PgRAV4转基因植株的第3、第6、第9节间木质素含量均显著低于野生型，说明PgRAV4在木质素的合成途径中起负向调控作用。对PgRAVs转基因烟草进行干旱胁迫处理，并测定了生理指标。其中PgRAV1转基因植株的叶片相对含水量、脯氨酸含量以及抗氧化酶活性均显著低于野生型，丙二醛含量显著高于野生型，说明PgRAV1转基因植株对干旱更敏感。以上这些研究结果为谷类作物抗旱育种提供了理论和实践基础。