NaCl胁迫下盐地碱蓬叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能分析

Suaeda salsa is a very special kind of succulent halophyte. It not only has the characteristics of accumulating saline ions in leaf succulence and green groups in the vacuoles to alleviating stress and ion toxicity, but has higher membrane lipid unsaturation. Our earlier research showed that the content of unsaturated fatty acids and phosphatidylglycerol (PG) increased significantly under salt stress. In this study, we isolated the glycerol-3-phosphate acyltransferase gene from Suaeda salsa, analyzed the expression of GPAT, constructed sense and antisense expression vector and transformed into wild-type and mutants of Arabidopsis thaliana. The transgenic plants were used to analyze the changes of antioxidant system, subcellular structure and fatty acid content, the relationship between unsaturation of membrane lipid and PSII and PSI. Thereby, we would try to clarify the regulation mechanism of unsaturated fatty acids in plant resistance to adverse stress.

盐地碱蓬是一类非常特殊的肉质化稀盐型盐生植物，不仅具有将盐离子积累在叶片肉质化组织及绿色组织的液泡中减缓盐渍离子的渗透胁迫和离子毒害的特征，还具备有较高的膜脂不饱和度。我们的前期研究发现在盐胁迫条件下盐地碱蓬叶片中不饱和脂肪酸和磷脂酰甘油（PG）的含量显著增加。本研究从盐地碱蓬叶片中分离与不饱和脂肪酸含量相关的甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）基因，分析该基因在盐地碱蓬中的表达情况；构建正义和反义表达载体，转化野生型拟南芥和拟南芥突变体，分析盐胁迫下转入GPAT基因拟南芥的抗氧化系统，亚细胞结构以及脂肪酸含量的变化；探讨SsGPAT基因的表达影响的类囊体膜脂不饱和度与PSII和PSI光抑制的关系，以及与膜蛋白功能与活性的关系。从而阐明SsGPAT调控的不饱和脂肪酸含量的变化在真盐生植物抗逆过程中的作用及分子调控机制。

本研究从盐地碱蓬叶片中分离得到叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，并对该基因的表达和功能进行了分析。同时研究了盐胁迫对拟南芥GPAT缺失突变体的影响。主要研究结果如下：.1. 利用拟南芥、番茄、菠菜、甜菜等植物中已知的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因设计一对简并引物。通过PCR的方法从盐地碱蓬叶片中克隆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的中间片段，再通过5’ RACE和3’ RACE技术克隆得到5’片段和3’片段，拼接全长后设计两端特异引物进行全长克隆。该基因编码区全长1167bp，编码388个氨基酸，分子量约为43 kDa。经过同源序列比对后发现，盐地碱蓬叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因与菠菜的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因同源性最高，达到87%。.2. 将获得的盐地碱蓬甘油-3-磷酸酰基转移酶基因与pB7WG2D载体重组，构建正义表达载体，利用花序侵染法获得拟南芥过表达株系。以叶片DNA为模板，根据表达载体上的35S启动子序列设计引物与基因3’端引物进行PCR扩增，检测过表达株系。.3. 在盐胁迫下，野生型拟南芥与过表达株系的萌发率、主根长度都受到了抑制，但是过表达株系受到的抑制程度较低，说明在萌发期过表达株系的抗盐能力更好；用RT-PCR检测过表达株系中盐地碱蓬甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的表达量，发现在100 mM NaCl条件下，表达量最高。用0和100 mM NaCl处理幼苗期的植株，测定叶片中的叶绿素含量、光合荧光参数、光系统I活性，结果发现，在盐处理下，过表达株系的叶绿素含量、ΦPSII、Fv/Fm及PSI活性显著高于野生型拟南芥，Fo、1-qP、NPQ显著低于野生型拟南芥。这说明与野生型相比，过表达株系受到盐胁迫的抑制作用更小，光合能力更强。通过测定PG脂肪酸组成发现，过表达株系PG中顺式不饱和脂肪酸的含量显著高于野生型拟南芥。.4. 选取SALK_136675C(ATGPAT6)，SALK_060056(ATGPAT2)， SALK_037660C(ATGPAT1)，SALK_045942(ATGPAT4)这四个突变体进行实验，结果发现，SALK_136675C和SALK_060056这两个突变体的抗盐能力显著低于野生型。盐处理下，SALK_136675C和SALK_060056的萌发率及主根长度显著低于野生型拟南芥。测定了幼苗期100 mM NaCl条件