利用质谱技术研究拟南芥响应逆境胁迫过程中磷酸化信号转导机制

Drought and salt stresses are major factors in affecting and limiting the productivity of agricultural crops. The study of biochemical and molecular responses of plants in response to those stresses is important for crop genetics and breeding. Extensive evidence shows that reversible protein phosphorylation plays a central role in mediating stress-regulated physiological responses, but little is known about its extent and function. Although pertinent protein kinases have been predicted and identified for drought or salt stress responses, classical biochemical approaches have so far revealed only a few candidate proteins and even fewer phosphorylation sites. Mass spectrometry provides a powerful tool for the in-depth analysis of systems biology. In this study, we will perform a global quantitative analysis of the Arabidopsis phosphoproteomics and metabolomics in response to a time course of stress treatments using 15N-metabolic labeling, subcellular fractionation and metabolite extraction approaches. To provide more evidence, we will analyse morphological and physiological responses as well, which will be combined with the proteomic and metabolomic data to investigate stress responsive molecular mechanisms.

干旱和盐胁迫是限制世界作物生产的主要环境因子。研究植物响应干旱和盐胁迫的生化和分子机制，能够为植物抗旱、抗盐的定向育种创造条件。近来研究表明蛋白质可逆磷酸化在响应植物逆境胁迫信号转导过程中具有关键作用，但具体作用机制并不清楚。尽管已经发现很多重要的蛋白激酶参与植物抗盐、抗旱信号转导机制，但传统的生化与分子生物学技术仅检测出小部分底物蛋白甚至更少数磷酸化位点。以质谱为主的磷酸化蛋白质组学研究和代谢组学研究相结合将大大推动这一领域的研究进展。本研究拟以拟南芥作为实验系统，通过15N稳定性同位素标记技术、亚细胞组分磷酸化蛋白分离纯化和代谢物分离与LC-MS/MS技术相结合，对逆境胁迫下蛋白质磷酸化和小分子代谢物进行精确定量动态分析。阐述蛋白激酶和底物间相互作用模式，同时借助细胞生物学技术和基本生理指标检测等技术，对蛋白质组学和代谢组学结果进行功能验证，探讨植物抵抗逆境胁迫信号转导机理。

本项目以模式植物拟南芥为材料，使用K15NO3标记植物材料，对植物进行不同时间的盐胁迫和氧化胁迫处理。分析胁迫信号转导过程中的蛋白质磷酸化通路和相关代谢通路，实现了首次系统地整合磷酸化蛋白质组学和代谢组学研究。磷酸化多肽定性和定量分析后，结果表明胁迫处理后521个磷酸化蛋白发生显著性的差异变化。通过Gene Ontology分析，这些蛋白可分为蛋白激酶、离子通道、转录因子、胁迫反应、代谢和细胞扩展等几类。与已经发表的数据相比较，我们的研究中检测到约1/3（150）的磷酸化位点是未报道过的新位点。例如，胁迫处理后SnRK1 家族两个控制stress response的重要蛋白，AKIN10 和AKIN11激酶磷酸化发生显著变化。其次，光合作用蛋白激酶STN7磷酸化程度被盐胁迫诱导提高。酶活性实验表明AKIN10 和AKIN11 调控了下游参与碳水化合物代谢酶的活性， 如SPS，phosphoglucomutase等酶活性均被调控。代谢组学数据表明与该通路相关的代谢物如sucrose，fructose和glucose含量在胁迫处理后有不同程度的积累。另外K+和Na+离子通道蛋白磷酸化程度发生协同调控。这些数据为胁迫诱导的蛋白磷酸化而激活酶活性从而调控下游代谢产物变化提供了有力的证据。