铜胁迫下紫鸭跖草特异表达蛋白的鉴定及其功能研究

Heavy metal pollution is one of the most widely and harmful environmental problem nowadays. It becomes an global challenge on the pollution abatement. Currently,the most advanced and universal adopted technique is phytoremediation. On this work, experimental material is a hyperaccumulator plant Setcreasea purpurea Boom reported by author’s team, screened from the copper mine at Dexing in Jiangxi province. After some basic researches were finished, which include the investigations on the growth situation and nutrients absorption for the cupric salt stressed Setcreasea purpurea Boom, understanding of the physiological response to cupric salt stress, distribution and morphological characteristics of intracellular copper and some specific expressed protein electrophoresis bands,further research apply MALDI-TOF to analysis the protein sequence of the cupric salt stressed Setcreasea purpurea Boom, meanwhile, PT-PCR is used to clone some related genes, primers is designed according to the protein sequence. To explore function and identify Setcreasea purpurea Boom specific protein expressed under cupric salt stress, tissue expression spectrum and major adversity responsed signals are analyzed. transgenic tobacco overexpressing associated protein is obtained, and the protein function is identified through testing the characteristic of those transgenic tobaccos,Then differentially expressed genes Loss-and Gain-function analysis.This work lay a foundation for understanding the molecular mechanism of the copper resistance of Setcreasea purpurea Boom, as well as for exploiting the hyperaccumulator Setcreasea purpurea Boom and some copper-tolerant transgenic plants for remediation and treatment of copper pollution.

重金属污染是当今面积最广、危害最大的环境问题之一，污染的治理是世界性的难题，目前主要采用较为先进的植物修复技术。本项目以课题组在江西德兴铜矿筛选出的并公开报道的超积累铜植物--紫鸭跖草为试验材料，在研究了铜盐胁迫下紫鸭跖草对营养元素的吸收和生长情况、生理反应、铜元素在细胞中的分布和形态特征以及特异表达的蛋白质电泳谱带的基础上，采用高通量测序平台的数字基因表达谱(DGE)技术，大规模的从转录组水平上鉴定受重金属铜响应的基因，并分析其组织表达谱和主要铜盐胁迫下的逆境相应信号；构建过量表达相关蛋白的转基因烟草，通过检测转基因烟草性状鉴定蛋白质功能，再将差异表达基因进行Loss- and Gain-function分析，从而完成铜盐胁迫下紫鸭跖草诱导表达基因及其蛋白质鉴定和功能研究，为深入研究紫鸭跖草耐铜性分子机理及超积累铜植物紫鸭跖草和转基因耐铜植物实际运用于铜污染的修复治理作基础性探索工作。

紫鸭跖草（Setcreasea purpurea Boom）是超累积铜植物，通过生物信息学方法从转录组数据库中挖掘稳定内参基因组合并对超累积铜植物紫鸭跖草根组织的热激转录因子基因家族进行初步的鉴定分析。主要结果如下：.1、测序共获得82471条的高质量unigene，并在6个生物数据库中进行基因功能注释。经过unigene差异表达水平的定量分析，获得了与铜诱导差异显著上调表达相关的应答基因。.2、从RNA-seq数据中获得8个内参候选基因，通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个不同的算法程序进行筛选，得出TUB、18SrRNA和UBI可以作为最稳定内参基因的组合。.3、从转录组数据库中初步筛选出20个热激转录因子基因家族成员，并对它们进行了初步的亚类区分、保守基序和结构域分析。初步发现5个潜在受不同铜浓度胁迫诱导上调表达的SpbHsfs基因。.4、蛋白组测序共获得5718个具有定量信息的蛋白质，其中鉴定到差异表达蛋白4163个。.5、转录组测序共获得82471条的高质量unigene，筛选得出共有5028条和9982条差异表达基因（DEGs），将转录组数据与蛋白质组数据合并分析，得到750个表达趋势相一致的DEPs/DEGs，对其做生物信息学分析并筛选得到了18个与铜胁迫相关的关键蛋白。.6、对筛选得到的18个差异表达蛋白进行平行反应监测（PRM）实验并与TMT定量蛋白质组学相比对，表明这18个差异表达蛋白确实是紫鸭跖草响应铜胁迫的关键蛋白。. 7、对紫鸭跖草 CpBURP进行了克隆、表达及生物信息学分析，qRT-PCR 结果显示，CpBURP 在根中的表达量高于茎和叶，在 Cu 2+ 胁迫条件下，根中 CpBURP 的表达量明显高于对照组。CpBURP 可能在紫鸭跖草的 Cu 2+ 胁迫应答反应中具有重要作用。. 8、利用生物信息学工具筛选紫鸭跖草的NAC转录因子家族和LIM 基因家族，并分析了 LIM 蛋白理化性质、亚细胞定位、蛋白结构和系统进化树。. 9、构建载体，全基因合成提供的 SOD 基因序列，亚细胞定位验证了SOD-YFP 融合蛋白在叶绿体中表达。