Hlfoo在牛卵两次减数分裂中功能差异的分子机制

卵特异连接组蛋白（Hlfoo）,在卵子成熟过程及早期胚胎前几个周期表达，参与染色体的空间构建。我们发现在牛卵内超表达Hlfoo蛋白可促进第一次减数分裂完成，但抑制第二次减数分裂（即卵母细胞激活）。本研究利用Roscovintine、6-DMAP、Milrinone和Flavopiridol等抑制剂将卵母细胞阻止在生发泡期或利用Aurora 激酶抑制剂ZM447439将卵母细胞阻止在MI期，最终使牛卵同期到达MI期。利用cRNA显微注射在同期化的MⅠ和MⅡ期牛卵内超表达Hlfoo蛋白；通过Morpholino片段注射抑制Hlfoo表达；利用抗体注射阻断Hlfoo蛋白功能。最后采用RT-PCR和Western blotting技术检测不同处理组卵内APC/C蛋白酶体降解系统和MAPK通路相关蛋白的表达变化，揭示染色体结构与细胞分裂的关联机制，阐明Hlfoo蛋白在两次减数分裂中功能差异的机制。

本项目需要揭示牛卵内超表达Hlfoo蛋白可促进第一次减数分裂完成，但抑制第二次减数分裂的分子机制。通过本项目的研究，取得以下结果：利用6-DMAP、Milrinone、Flavopiridol以及Nocodazol处理获得同期化牛卵难度很大，适量的Roscovintine可以抑制大约70%左右的生发泡期牛卵的发育，并且抑制过程可逆；利用cRNA注射技术可以达到对于卵内特定蛋白的超量表达，而Morpholino片段注射可以显著降低目的蛋白的表达量；Hlfoo蛋白超量表达能够促进第一次减数分裂完成，敲降Hlfoo蛋白使得卵母细胞的成熟率下降；除Hlfoo蛋白之外，发现其他蛋白质（cyclin B1, cdc20等）在两次减数分裂过程中的功能也存在差异，说明特定蛋白在两次减数分裂中存在功能差异是一个共性问题，是由卵子两次减数分裂间细胞质的差异引起，这些细胞质中的差异因素需要进一步研究。卵内Hlfoo在核移植过程中能够置换供体细胞核内连接组蛋白，但是在体细胞内表达Hlfoo蛋白并不能够提高其形成ips细胞的效率。