新型Notch信号通路阻断剂KyoT2对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的治疗作用及分子机制研究

The abnormal activation of Notch signaling is the major reason of the acute T-lymphoblastic leukemia occurrence. Although GSI can block the ligand-triggered Notch receptor activation, it can not block the constitutive non-ligand-dependent Notch receptor activation which caused by T-ALL chromosomal translocations or mutations. Inhibition of RBP-J, the Notch signaling hub, is expected to achieve broad-spectrum inhibition of the abnormal activation of Notch signaling. It has found that the KyoT2 protein with LIM domain can inhibit RBP-J-mediated Notch signaling activation and induce T-ALL cell apoptosis, suggesting that Notch signaling blockers which template designed on KyoT2 may be used in the T-ALL treatment. This project intends to characterize the abnormal activation level of Notch signaling in T-ALL patients, designs to clarify the relationship between the KyoT2 expression and the T-ALL cells apoptosis levels in vitro and in vivo by using KyoT2 lentiviral expression vector and siRNA inhibition assay, attempts to elucidate the molecular mechanisms of Notch signaling inhibition by KyoT2, offers to provide the theoretical foundation and scientific basis for the pathogenesis and treatment strategies of T-ALL.

Notch信号异常活化是T细胞急性淋巴细胞白血病的主要病因。GSI虽可阻断配体触发的Notch受体活化，但不能阻断T-ALL染色体易位或突变造成的Notch受体非配体依赖的组成性活化。而抑制RBP-J这一Notch信号的中枢，有望实现广谱抑制Notch信号异常活化。我们发现LIM结构域蛋白 KyoT2可抑制RBP-J介导的Notch信号的活化，并诱导T-ALL细胞凋亡，提示以KyoT2为模版设计Notch信号阻断剂可望用于T-ALL治疗。本课题拟在进一步明确T-ALL患者Notch信号异常的基础上，利用慢病毒表达KyoT2和siRNA抑制KyoT2，观察KyoT2过表达和抑制在体内外对T-ALL细胞增殖凋亡的影响；探讨KyoT2抑制Notch信号对 T-ALL作用的分子机制；并尝试以KyoT2为基础设计Notch信号的短肽阻断剂。为深入了解T-ALL的发病机制及建立新的治疗策略奠定基础。

急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)是来源于早期T淋巴细胞的高侵袭性恶性肿瘤，预后差，深入研究T-ALL的发病机制，寻找新的治疗手段，具有着重要意义。Notch信号异常活化是T-ALL的主要病因。GSI虽可阻断配体触发的Notch受体活化，但不能阻断T-ALL染色体易位或突变造成的Notch受体非配体依赖的组成性活化。而抑制RBP-J这一Notch信号的中枢，有望实现广谱抑制Notch信号异常活化。我们发现LIM结构域蛋白KyoT2可抑制RBP-J介导的Notch信号的活化，并诱导T-ALL细胞凋亡，提示以KyoT2为模版设计Notch信号阻断剂可望用于T-ALL治疗。.我们首先构建了表达人源化的LIM结构域蛋白FHL1C的真核表达载体pCMV-myc-FHL1C和pEGFP-C1-FHL1C以及慢病毒表达载体pLenti/V5-FHL1C-IRES-GFP。在急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中证实FHL1C高效表达，并发现在Jurkat细胞中过表达FHL1C可诱导细胞凋亡。然后，我们探讨了过表达FHL1C促使Jurkat细胞凋亡的分子机制。证实FHL1C同样可抑制RBP-J介导的Notch信号途径的转录，抑制下游与T-ALL发生相关分子Hes1、Hes5和c-Myc的表达，促进凋亡相关基因，如Fas和Caspase-3等的表达，抑制抗凋亡基因，如Bcl-2和Bcl-xl等的表达。以上这些研究结果提示过表达FHL1C可能对T-ALL具有靶向杀伤作用，为进一步深入研究FHL1C促T-ALL细胞凋亡的分子机制奠定基础，并为以FHL1C为靶标，设计不受细胞微环境影响、并特异靶向RBP-J的新型Notch信号阻断剂提供理论研究基础。.本项目还通过基因修饰小鼠骨髓抑制模型，研究了 Notch信号途径对骨髓损伤后应激造血的调控作用。研发新型内皮靶向Notch信号激活剂mD1R重组蛋白，在细胞和分子水平确认蛋白活性后，从整体动物水平评估Notch活化配体mD1R在电离辐射以及化学药物所致骨髓抑制模型中的生物学效应。结合生物信息学和分子生物学等手段，对Notch信号通路调控应激造血损伤后骨髓重建的分子机制进行了探讨。为后续研发促进骨髓抑制患者造血重建的新型辅助用药奠定了基础。