蛋白质巯基亚硝基化修饰对自噬关键蛋白ATG4的功能调控和机制研究

We found that ATG4B, one of the cysteine protease ATG4, can be S-nitrosated during the inhibition of cellular autophagy by nitric oxide treatment. We will further study the mechanism of this inhibition on the levels of biochemistry and cell biology. With our specific IBP method for detection of protein S-nitrosation combining with mass spectrometry assisted methods, we will define the exact cysteine sites which is specifically S-nitrosated and then use site-specific mutation for verificaiton. Furthermore, we will study the effects of this modification on the priming and delipidation enzymatic activities of ATG4B, the selectivity of ATG4B substrates and structure of ATG4B. We will also study the effects of ATG4B S-nitrosation on formation of autophagosomes, digestion of autophagic substrates and cell autophagy. In order to uncover the cellular mechanism, we will develop a method for studying substrate selectivity of ATG4B S-nitrosation based on SILAC method. This study will reveal the precise regulation mechanism of cell autophagy by nitric oxide through the new angle of S-nitrosation and give new pathways for study of oxidative stress under physiological and pathological conditions.

一氧化氮可以通过对蛋白质半胱氨酸巯基修饰-蛋白质巯基亚硝基化修饰调控蛋白功能。我们发现在一氧化氮抑制的细胞自噬过程中，自噬关键蛋白Cysteine protease ATG4的亚型ATG4B可发生亚硝基化修饰并调控其酶活。本课题将深入研究ATG4B亚硝基化对其功能的调控和细胞效应机制。基于我们已建立的亚硝基化特异检测方法（IBP方法），结合定量质谱方法，确定ATG4B亚硝基化修饰的特异性位点并利用定点突变验证；研究亚硝基化修饰对ATG4B的酶活（启动活性和去脂质化活性）、底物选择性以及结构以及对自噬体形成、自噬蛋白底物降解及细胞自噬的影响；利用定量蛋白质组学方法分析鉴定ATG4B亚硝基化将调控哪些蛋白并进行生物信息学分析，揭示ATG4B亚硝基化调控的信号通路和细胞效应机制。研究结果将阐明一种细胞自噬调控的新机制，揭示氧化/硝化应激在生理病理过程中发挥作用的新通路 - 调控细胞自噬。

一氧化氮可以通过对蛋白质半胱氨酸巯基修饰──蛋白质巯基亚硝基化修饰调控蛋白功能。我们发现在一氧化氮抑制的细胞自噬过程中，核心自噬蛋白ATG4B发生亚硝基化修饰。本课题将深入研究ATG4B亚硝基化修饰对其蛋白功能和细胞自噬的调控。我们发现糖尿病GK大鼠海马中自噬水平降低，且高糖可以降低小鼠原代海马神经元中的自噬水平。基于我们已建立的亚硝基化特异检测方法（IBP方法），确定高糖条件下产生的NO可以使ATG4B发生亚硝基化修饰。我们用质谱结合位点突变的方法，确定ATG4B在半胱氨酸189和292位发生亚硝基化修饰。亚硝基化修饰可以降低ATG4B的酶活（启动活性和去脂质化活性）且出现底物选择性（NO对ATG4B切割ATG8L前体的抑制程度最小），降低ATG4B蛋白结构的柔性，通过影响自噬前体的形成而抑制细胞自噬。最终，我们也确定ATG4B的亚硝基化修饰可以介导高糖诱导的自噬缺陷和神经细胞毒性。我们的研究结果揭示了糖尿病中枢神经系统病变的新机制：高糖条件下ATG4B亚硝基化修饰介导的自噬缺陷导致神经细胞毒性。同时也揭示了自噬机器蛋白中的一种新的翻译后修饰──巯基亚硝基化修饰。