食管鳞癌中新发现的EP300高频突变对其酶活性及细胞功能影响的研究

EP300 is a histone acetyltransferase (HAT), which facilitates the recruitment of specific transcription factors and cofactors and the formation of transcriptional complex. Some mutations occur in HAT domain of EP300 result in the loss of enzyme activity, the inhibition of transcription, which play a role in the occurrence and progression of cancer. Our study shows that there are ~10% non-synonymous mutations found in the HAT region of EP300. As a result, the survival time after the operation was significantly shorter in patients with mutation than those without. Tyr1414Cys accounts for up to 40% among all the mutations, and there have been no report of this mutation so far. In this study, we aim to study the function and role of this mutation played in esophageal cancer: 1) Screen wild-type cell line of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). 2) Construct ESCC cell lines using TALEN technology to introduce specific mutation, Tyr1414Cys in HAT region of EP300. 3) Measure the impact of Tyr1414Cys mutation on HAT enzyme activity of EP300. 4) Evaluate the effects of EP300 mutation on cell function. 5) Further study the changes made by Tyr1414Cys mutation to the downstream signaling pathways in the esophageal squamous cell carcinoma. This study will further illustrate the roles of EP300 and the epigenetic alterations during tumorigenesis and cancer progression in esophageal squamous cell carcinoma.

EP300是一种组蛋白乙酰转移酶（HAT），也在转录激活因子和基本转录复合物之间起桥梁作用，为多组分转录复合物的组装提供支架。多种肿瘤中EP300 HAT区发生突变，导致其酶活性丧失和转录抑制，参与肿瘤发生发展。我们的研究发现EP300 HAT区发生了约10%的非同义突变，导致病人的术后生存时间明显缩短；Tyr1414Cys位点的突变约占总突变的40%。这一突变对功能的影响未见报道。本项目将进行这一突变的功能研究：1)筛选出含有野生型EP300基因的食管鳞癌细胞系，2)利用TALEN构建EP300 Tyr1414Cys定点突变的细胞株，3）检测突变对EP300 HAT活性的影响，4）研究EP300突变后对细胞功能的影响，5）进一步研究食管鳞癌细胞中EP300突变引起的下游信号通路的改变。本研究深入揭示EP300在肿瘤发生发展中的作用及表观遗传改变在食管鳞癌发生发展中的作用。

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，我国食管鳞癌发病率及死亡率居世界首位，是危害我国人民健康的主要恶性肿瘤之一。EP300是一种组蛋白乙酰转移酶，在转录激活因子和基本转录复合物之间起到桥梁作用，为多组分转录复合物的组装提供支架。它的HAT区域发生突变会导致酶活性丧失和转录抑制，参与肿瘤的发生发展。我们前期研究发现EP300 HAT区域发生约10%的非同义突变，导致病人的预后显著变差；其中Tyr1414Cys位点的突变约占总突变的40%。但这一突变的功能尚未被报道。本项目中我们利用测序技术检测细胞系的EP300基因并挑选出野生型细胞系。通过CCK8、Transwell、平板克隆等检测发现，敲降野生型EP300会显著抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、转移能力。通过流式细胞检测，证实敲降EP300可明显增加食管鳞癌细胞晚期凋亡细胞数。但通过免疫组化研究发现，EP300突变与表达量之间没有显著相关性，其突变引起的预后差是通过其他机制来影响细胞活性。因此，我们使用CRISPR技术在KYSE-150中成功构建EP300 Tyr1414Cys点突变细胞株。通过免疫印迹方法检测组蛋白修饰水平变化，发现EP300对维持乙酰化水平其中重要作用。同时EP300野生型与突变型的过表达实验也证明了仅有野生型过表达可显著提高乙酰化水平。细胞功能实验证实，EP300突变型细胞株的增殖能力显著下降。综上可见，EP300突变基因在食管鳞癌的高频突变可引起酶活性丧失，降低乙酰化水平，抑制肿瘤细胞的增殖等功能，在食管鳞癌的发生发展中起到的重要作用。