急性髓细胞白血病中高表达白血病相关Rho鸟苷酸交换因子的发病学和治疗学意义研究

The leukemia-associated rho guanine nucleotide exchange factor is one GEF of Rho-GTPase to activate Rho subfamily and to trigger downstream signaling. Rho family with broad spectra of function has important role in regulating normal hematopoiesis and in hematopathy. Previous studies of ours showed LARG was highly expressed in all AML1-ETO positive AML and part of other AML without AML1-ETO. And furthermore, the expression pattern of LARG was highly correlated to the prognosis of patients. In vitro studies revealed that LARG was important for growth of cells with AML1-ETO. Based on these findings we hypothesized that LARG affected proliferation and survival of AML by activating Rho-GTP or other unknown pathways. In some cases of AML, LARG would be very important for their leukemogenesis and have influence on their sensitivity to chemotherapy and prognosis. In this proposed project, our clinical observations will be our clues for further study. By transduction and RNA interference, the effects of LARG at different expression levels will be documented and the underline mechanism will be studied. Finally, for the reagents Y16 and G04 can specifically interfere LARG/RhoA interaction, we try to study the potential value of them to treat AML with high LARG expression or overcome their chemoresistance.

白血病相关Rho鸟苷酸交换因子（LARG）是一种Rho-GTP酶的鸟苷酸交换因子可以激活Rho亚家族，从而触发下游的信号通路。Rho家族作用广泛，在正常造血细胞和病态造血中均有重要作用。前期研究显示LARG在所有AML1-ETO阳性AML及部分AML1-ETO阴性AML中高表达，而且和预后相关。我们发现LARG和AML1-ETO阳性AML生长关系重大。为此，我们假设LARG通过激活Rho-GTP或其它未知的分子机制影响AML细胞的增殖、生存，在部分AML的发病中有重要作用。同时影响AML患者对化疗的敏感性和疾病预后。本项目拟在大量临床病例研究的基础上，通过基因转导和RNA干扰，研究不同LARG表达状态对AML细胞生物学行为的影响；并研究其内在的分子机制；最后通过离体细胞实验以及人源化小鼠的AML移植模型研究新开发的LARG/RhoA抑制剂Y16和G04治疗LARG高表达AML的潜在价值。

Rho鸟苷交换因子12（ARHGEF12）,也称白血病相关的Rho鸟苷交换因子（LARG），特异性催化与Rho家族成员RhoA结合的GDP和GTP进行交换，形成RhoA-GTP，从而激活RhoA并参与下游信号通路而发挥生物学功能。前期研究显示LARG在所有AML1-ETO阳性AML及部分AML1-ETO阴性AML中高表达，我们的研究表明ARHGEF12高表达组AML病人生存率低，复发率高，预后不佳。在AML1-ETO阳性的Kasumi-1敲低ARHGEF12可以抑制细胞生长，诱导凋亡。但对AML1-ETO阴性ARHGEF12高表达的U937生长影响不大。.目前为止，LARG在造血中的作用尚不清楚。我们首次利用红白血病细胞系K562和模式生物斑马鱼，发现了LARG在红系造血中发挥的重要作用。我们在斑马鱼中利用反义寡核苷酸介导的敲低技术同时敲低了ARHGEF12的两个同源基因：arhgef12a 和arhgef12b后，发现斑马鱼原始造血并没有受影响，而定向造血阶段的成熟红细胞明显减少。我们进一步分析了arhgef12a 和arhgef12b的功能之后发现，这两个基因在红系造血中均有重要作用，只是它们作用的阶段不同。这种由于arhgef12a 和arhgef12b基因功能缺失导致的红系分化受阻的表型可被过表达的RhoA持续活化突变体的mRNA所纠正。而注射RhoA显性负突变的mRNA可以产生类似于arhgef12a 和arhgef12bMO注射的表型。我们利用红白血病细胞株K562进行了蛋白激酶芯片分析，发现敲低ARHGEF12表达后p38 MAPK上游分子MAPKAPK2的磷酸化明显下降，,提示RhoA下游的p38 MAPK信号通路的活化减少可能是导致这一表型的原因。而事实证明，注射arhgef12a 和arhgef12b MO的斑马鱼胚胎用p38 MAPK的激动剂（茴香霉素）处理后，红系减少的表型是可以被纠正的。同样相符的是，芯片中提示的p38下游的因子stat1a的过表达也可以回复红系分化受阻的表型。在斑马鱼中利用cas9技术敲除arhgef12a 和arhgef12b后可见红系祖细胞和成熟红细胞均减少，红系造血分化受阻。我们已经构建了ARHGEF12条件性基因敲除小鼠模型，可用在发育的任何时期任何器官敲除基因表达，是很好的研究模型。