狭义耳草属植物两型花柱进化、维持及破损的细胞与分子机制

异型花柱系统是研究植物进化与适应的经典范式。茜草科是被子植物中异型花柱最为集中的科，所包含的具异型花柱属、种数量超过其它所有科之和。本项目拟通过对茜草科耳草属（Hedyotis）植物不同交配系统类型（单一花型的花柱缩入式雌雄异位、单一花型的花柱伸出式雌雄异位、雌雄异株、两型花柱）植物传粉昆虫类型及其传粉效率的观察，结合其自交亲和性的研究，旨在揭示两型花柱交配系统在该类群中的起源与演化，并对两型花柱起源演化的有关理论假说进行实证检验；通过结合细胞学、蛋白质组学以及小RNA研究对耳草属植物异型自交不亲和以及隐性自交不亲和两种系统的比较研究，探讨两型花柱系统的维持机制以及破损的生态因素、自交不亲和性的细胞与分子机制。通过对耳草属交配系统及其维持机制的研究，为耳草属植物乃至其它异型花柱植物的有效迁地保护提供理论支撑。

运用透射电镜、免疫单克隆抗体标记、激光共聚焦扫描显微术以及蛋白质组学等技术对具有隐性自交不亲和系统的金草和具有异型自交不亲和系统的牛白藤两种二型花柱植物进行研究，主要结果如下：1) FM4-64对体外培养的金草与牛白藤花粉管细胞内囊泡动态标记发现，金草长柱型花粉管的囊泡主要集中在亚顶端，且囊泡与质膜融合速度较慢，短柱型花粉管的囊泡主要集中在顶端且融合速度较快；牛白藤两柱型花粉管囊泡均先集中于顶端，最后集中在亚顶端，短柱型花粉管囊泡与质膜融合速度较长柱型快。两种植物的短柱型囊泡与顶端质膜的融合速度都比长柱型快，且金草囊泡融合速度较牛白藤快。对两种植物花粉管细胞壁成分的免疫荧光标记结果发现，金草长柱型花粉管顶端积累了较多胼胝质和酸性果胶质，甲酯化果胶均匀分布于整个花粉管。金草短柱型和牛白藤长/短柱型的分布模式一致，花粉管顶端积累了较多甲酯化果胶，顶端无胼胝质积累，酸性果胶在花粉管两侧环状分布。两种阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)在两种植物同型的分布模式一致，长柱型AGPs均匀分布于整个花粉管，短柱型AGPs顶端较多，环状或均匀分布。2) 人工授粉处理后，金草短柱型花粉粒淀粉降解较长柱型迅速，亲和花粉管中，各细胞器结构正常，短柱型不亲和反应较剧烈。与金草相比，牛白藤自交处理后花粉管细胞内不亲和反应较型内处理剧烈，短柱型不亲和反应较长柱型更剧烈；在自交不亲和反应初期不亲和反应较金草迅速且开始出现液泡化，中后期时结构破坏、液泡化也较明显。3）利用双向差异凝胶电泳技术分离花柱全蛋白，比较了牛白藤长/短柱型型间异交和自交后花柱中蛋白质表达谱的变化。经分析显示，有109个蛋白表达发生变化，差异蛋白经MALDI-TOF-TOF-MS分析鉴定，以及NCBI数据库搜索，最终鉴定出43个蛋白，属于36种基因产物。它们分别参与碳固定/光合作用、碳水化合物及能量代谢、胁迫及防御反应、信号转导、蛋白质生物合成与分解代谢等过程。以上细胞学研究结果表明金草长柱型和短柱型之间花粉管的囊泡转运、细胞壁成分分布存在较大差异，而牛白藤两型之间差异较小；发生不亲和反应时牛白藤花粉管的超微结构变化较金草迅速且剧烈，短柱型的不亲和性较强。牛白藤差异蛋白质组学研究表明长/短柱型之间可能存在不同的不亲和机制。