新疆阿魏菇凝集素构效关系及其免疫调节机理的研究

阿魏菇是新疆特色菌类，其味美鲜嫩，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、氨基酸，凝集素等。凝集素是菌类的重要活性成分，具有多种生物活性：免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、识别细胞表里面糖蛋白、凝集各类细胞等作用。本项目旨在通过固定化红细胞亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法从阿魏蘑菇中分离纯化出具有免疫调节活性的凝集素，建立凝集素高效分离纯化方法；研究阿魏菇凝集素的理化性质；通过体外细胞试验确定凝集素作用的靶细胞，研究凝集素对靶细胞丝裂原活化蛋白激酶中关键蛋白的影响，以及靶细胞各种细胞因子表达水平的变化；通过正常小鼠和免疫抑制小鼠研究凝集素对机体的免疫调节水平，揭示凝集素免疫调节机理；并通过红外光谱、核磁共振、原子力扫描、氨基酸测序等研究凝集素糖链与蛋白结合特性、特征基团、微观平面结构、糖链缀合和N段序列，探讨阿魏蘑菇凝集素的免疫调节机理与结构之间的关系，为阿魏菇产品的开发提供理论基础与技术支持。

本研究以新疆特色资源阿魏菇作为研究对象，主要研究其分离纯化，理化性质，结构特性与免疫调节活性等。凝集素也作为识别细胞表面结构的一种工具，凝集素可以与细胞表面的糖链结合。.(1) 通过蒸馏水浸提、75%硫酸铵沉淀、离子交换层析及琼脂糖凝胶亲和层析法纯化了阿魏菇凝集素(pleurotus ferulae Lectin，PFL)，通过糖微阵列分析检测了凝集素的凝血活性与凝血抑制活性。SDS-PAGE实验结果显示该凝集素分子量为17.5KD，凝血抑制试验表明PFL凝血活性受到葡萄糖，乳糖和半乳糖，半乳糖苷的抑制。当温度在0-60℃凝血活性稳定，凝血活在80℃以上凝血活性基本消失，改凝集素不耐高温；当pH 6-9凝血活性最强，金属离子Mg2+ 和Ca2+可以抑制其凝血活性。原子力显微镜分析显示，该凝集素为一种糖链缀合的球蛋白，其蛋白直径约为20-35nm，在蛋白的周围都链接有不同长度和数量的链状结构，长度从60nm-330 nm不等，蛋白含量为84.33% 糖含量为15.67%。红外光谱分析主要吸收峰有3419.8cm-1，1788cm-1，1651cm-1，1408 cm-1、1217cm-1，1124cm-1。.(2)现阶段实验表明凝集素对巨噬细胞的作用发挥其免疫调节的作用，凝集素与巨噬细胞共培养时，当凝集素浓度到达20 μg/ml，巨噬细胞吞噬活显著提高。凝集素对巨噬细胞产生NO，IL-6和TNF-α具有显著的增高作用，并且在剂量和时间上呈现要依赖关系。凝集素能够影响巨噬细胞包内总蛋白的表达，基于这一现象，实验进一步研究了巨噬细胞内MAPK信号转导途径中关键蛋白的变化，分别通过ELISA和Western blot检测了IL-6与ERK和p38信号通路之间的关系，首先采用抑制剂PD98059抑制ERK关键蛋白的表达，此时考察凝集素作用于巨噬细胞时，ERK与IL-6前体的表达水平的变化关系；同样的原理采用SB203580作用于巨噬细胞，考察p38与IL-6前体的表达水平的变化关系；根据实验结果可知38抑制剂SB203580使p38蛋白失去活性时，IL-6表达量也随之减少。说明IL-6的表达与p38通路具有相关性。.(3) 动物实验结果表明正常小鼠在不同剂量的凝集素（400, 800, 1200μg/Kg）作用后小鼠的脾脏指数、胸腺指数、吞噬指数和半数溶血值(HC50)