水杨酸羟基化调控水杨酸动态平衡的分子机理研究

Salicylic acid (SA) is a key phenolic hormone which plays essential roles in plant disease resistance, stress responses, senescence and development. It is critical for plants to modulate SA homeostasis under different conditions. SA hydroxylation is an important modification and is regarded as the major detoxification pathway to maintain the SA homeostasis in plants. Two SA hydroxyl products 2, 3-and 2, 5-dihydroxybenzoic acid (2, 5-DHBA) were reported to be the major hydroxyl SA in Arabidopsis. We have previously characterized the salicylic acid 3-hydrxoylase (S3H) which can convert SA to 2, 3-DHBA in vivo and in vitro. So far, the SA 5-hydroxylase (S5H) which converts SA to another hydroxyl product 2, 5-DHBA is still unknown. In addition, the regulation network of S3H and S5H at both transcriptional and post-transcriptional levels remain elusive. In the current proposal, we will characterize the S5H enzyme by reverse genetics strategy and further investigate its biochemical properties. Taking advantage of knock-out mutant of s5h, we will compare the biological functions of S5H and S3H in plant leaf senescence and disease resistance. Moreover, we will study the regulatory mechanisms of S3H and S5H genes at both transcriptional and post-transcriptional levels. Our research ultimately contributes the elucidation of the biochemical basis of SA metabolism and the modulation mechanism of salicylic acid homeostasis by SA hydroxylation.

水杨酸（SA）是一种酚类植物激素，在植物抗病、抗逆、衰老和生长发育中起到关键作用。维持SA在植物体内的动态平衡对其正常行使生物学功能至关重要。SA羟基化是SA的重要修饰方式，被认为是植物清除体内过多SA而维持SA动态平衡的主要途径。拟南芥中存在2，3-和2，5-二羟基苯甲酸（2，3-和2，5-DHBA）两种SA羟基化产物。我们已经报道了负责生成2，3-DHBA的SA 3-羟基化酶（S3H），但是负责生成2，5-DHBA的SA 5-羟基化酶（S5H）和SA羟基化调控SA动态平衡的分子机理还不清楚。本项目前期工作利用反向遗传学鉴定了S5H酶，初步研究了S5H的生化特性和生物学功能，在此基础上将深入探究S5H的生物学功能，进一步筛选调节S5H/S3H的转录因子和互作蛋白，解析SA羟基化调控SA动态平衡的分子机理。本项目对于阐明SA代谢途径和分子调控网络具有重要的科学意义。

水杨酸（SA）是植物通过次生代谢途径产生的一种酚类激素，在植物抗病、衰老、抗逆以及生长发育过程中发挥重要作用。羟基化是SA的重要修饰形式，被认为是植物清除体内过多SA的主要解毒途径。催化SA生成2，3-DHBA的SA 3-羟基化酶（S3H）已被鉴定，但是催化SA生成2，5-DHBA的SA 5-羟基化酶（S5H）以及SA羟基化酶调控SA动态平衡的分子机理尚未见报道。本项目针对以上问题开展研究，取得如下研究结果：.1..鉴定了SA 5-羟基化酶。 建立了SA羟基化酶的体外酶活检测系统，筛选受SA诱导的2-酮戊二酸依赖性亚铁加氧酶家族基因，获得一个能催化SA生成2，5-DHBA的SA 5-羟基化酶。对该重组酶的生化活性进行了详细地研究，结果表明该酶的Km 约为5.15 μM， Vmax 约为357.1 nmol/mg protein/min， 与已发表的S3H 比较，该酶具有更强的底物结合活性，且具有底物抑制活性，底物抑制常数约为6.05 μM。证明植物体内的2，5-DHBA 来源于酶促反应而不是简单的化学反应。.2..S5H参与植物抗病和叶片衰老的生物学功能研究。利用启动子融合GUS和定量PCR技术对其表达特征进行分析，与S3H相比较，S5H的表达对SA诱导更加敏感，从幼苗直至衰老时期持续表达，而S3H 只在叶片衰老与病原菌诱导条件下特异表达。s5h 突变体和s3hs5h 双突变体具有很强的抗病表型以及叶片衰老相关表型，证明S5H和S3H协同调节SA羟基化，调控植物SA动态平衡。.3..S5H基因的表达调控。利用酵母单杂交系统对S5H基因的调控序列进行筛选，获得15个候选转录因子，对这些转录因子的表达以及生物学功能进行了初步研究。鉴定了一个能够调控S5H基因表达的WRKY转录因子。.总之，本项目鉴定了S5H基因及其调控蛋白，阐明其和S3H协同调控SA动态平衡的分子机理，为研究SA调控植物抗病和生长发育打下基础，同时为植物抗病和抗衰老改良提供重要基因资源。