菊芋果聚糖1-外切水解酶（1-FEH）基因克隆、表达和调控模式研究

Fructan 1-exohydrolases (1-FEHs) participate in the degradation of plant fructan and contribute to abiotic tolerance. Among the angiosperms that store high amount of fructans, Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus) is one of the most noted due to abiotic resistance. Until now only limited information about Jerusalem artichoke's 1-FEHs was available. In the present work, cloning and function of Ht1-FEHs will be provided. The recombinant Ht1-FEHs will be expressed in Pichia pastoris for determination of some of its physical and kinetic properties. Through Real-Time PCR technique and Western Blot, the expression level of identified Ht1-FEHs will be quantified in a time-course experiment with or without abiotic treatment. Both 1-FEHs enzyme activity and fructan content will be monitored also. The regulatory mechanism behind different Ht1-FEHs expression was demonstrated through promoter analysis by transient expression assay(onion epidermal cell and Jerusalem artichoke tissue explant). In a conclusion, characterization of the Ht1-FEHs may provide tools to study abiotic tolerance in plants and to increase its industrial application in the future.

果聚糖1-外切水解酶（1-FEH）参与植物果聚糖的水解，提高植物抗逆境性能。菊芋作为一个富含果聚糖和耐受性高的草本植物，针对其体内1-FEH的研究目前还比较缺乏，菊芋1-FEH基因信息及逆境下的功能和调控研究几乎空白。因此，本项目拟克隆出菊芋多个1-FEH基因，并利用毕赤酵母异源表达系统鉴定并明确菊芋各1-FEH酶的基本特性。利用实时PCR和Western Blot技术测定菊芋各1-FEH在植物全生育期和不同逆境处理下的时空表达特征，同期检测植物中1-FEH酶活和植物果聚糖组成成分变化，明确各1-FEH在菊芋正常生长和逆境中的功能和作用方式。通过克隆各菊芋1-FEH的启动子，并在洋葱和菊芋外植体瞬时系统分别表达，探索菊芋各1-FEH在不同处理下表达差异的内在原因。通过本项目可以明确菊芋各1-FEH基因的功能与调控模式，为提高植物抗逆性能及工业化生产果糖类产品奠定理论基础。

果聚糖水解酶可以水解果聚糖产生果糖，其可在植物抗逆境中发挥重要功能。两个菊芋的果聚糖水解酶以前报道过，有一个蛋白还被纯化到单一条带，但至今并没有相应的核苷酸序列报道过。在这个研究中，我们从菊芋中克隆了两个全长的果聚糖基因序列，分别命名为Ht1-FEH I and Ht1-FEH II。这两个菊芋的果聚糖水解酶同菊苣的果聚糖水解酶具有很高的相似性。通过利用毕赤酵母X-33，我们体外表达了这两个果聚糖水解酶，发现这两个酶对β(2,1)连接的果聚糖具有很高的水解活力，但对β(2,6)连接的果聚糖几乎没有活力。类似于其他果聚糖水解酶，蔗糖会抑制这两个果聚糖水解酶的酶活。实时定量PCR分析发现菊芋Ht1-FEH I在幼嫩的叶子和茎秆中表达水平较高，而Ht1-FEH II在块茎萌发中表达较高，说明这两个菊芋果聚糖水解酶具有截然不同的角色。茎中这两个果聚糖水解酶受到氯化钠的诱导，同时氯化钠也诱导这两个果聚糖水解酶在块茎中的积累。PEG（模拟干旱）轻微地诱导这两个果聚糖水解酶在块茎中的积累。通过利用液相色谱我们分析了块茎在氯化钠和PEG处理下的果聚糖代谢的酶活变化和糖分变化。我们发现糖分的变化（果糖）水平同果聚糖的酶活水平以及基因表达水平存在不一致，本研究认为可能是块茎中蔗糖抑制果聚糖水解酶的功能发挥。