糜酶抑制剂通过TGF-β1/Smad信号通路调控肝星状细胞增殖活化的分子机制研究

Angiotensin II (AngII) and TGF-1/Smad signal transduction pathways play an important role in the formation of hepatic fibrosis, and the hepatic stellate cells (HSC) activation and proliferation are the central link of hepatic fibrosis. Chymase is another way to generate AngII. Our preliminary data demonstrated that chymase inhibitor (Chy-I) reduced the expression of -SMA, type I collagen in rat liver fibrosis tissues, but the molecular mechanism remains unclear. In this study, using rat hepatic fibrosis model, we will first examine the expression of different pathway components of AngII and the molecules of TGF-1/Smad signaling pathway during the intervention of Chy-I. Next, we wll investigate the potential cross talk between AngII and TGF-1/Smad signaling pathways in the process of the chymase-mediated hepatic fibrosis. To clarify the targets of Chy-I on AngII-mediated TGF-1/Smad signaling pathway, based on above research, we will further explore whether Chy-1 inhibts the activation of HSC proliferation through blocking the AngII and TGF-1/Smad signaling pathway in cultured HSC. Finally, we will verify the molecular mechanisms of Chy-I on inhibition of the activation or proliferation of HSC in anti-hepatic fibrosis. Our results will provide a theoretical basis for future anti-fibrotic therapy.

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和TGF-β1/Smad信号转导通路在肝纤维化形成中起重要作用，而肝星状细胞（HSC）活化增殖是肝纤维化发生的中心环节。糜酶是生成AngⅡ的另一途径，我们的前期研究发现糜酶抑制剂（Chy-I）可减轻肝纤维化大鼠肝组织α-SMA、I型胶原的表达，但其分子机制尚不清楚。因此本项目利用大鼠肝纤维化模型，首先观察Chy-I干预治疗中AngⅡ系统不同环节组分及TGF-β1/Smad信号分子的表达，探讨糜酶介导的肝纤维化病理过程中有无AngⅡ和TGF-β1/Smad两个信号途径的交叉，在此基础上利用培养的HSC，观察Chy-I是否通过阻断TGF-β1/Smad信号转导通路抑制HSC的增殖活化，以阐明Chy-I对血管紧张素Ⅱ介导的TGF-β1/Smad信号通路的作用靶点。探讨Chy-I抗肝纤维化过程中抑制HSC活化或增殖的作用及其分子机制，为抗纤维化治疗提供理论依据。

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和TGF-β1/Smad信号转导通路在肝纤维化形成中起重要作用 ，而肝星状细胞（HSC）活化增殖是肝纤维化发生的中心环节。鉴于糜酶在肝纤维化形成过程中起重要的作用，本项目通过体外试验探讨糜酶抑制剂（Chy-I）对大鼠HSC增殖及TGF-β1等肝纤维化因子的影响；通过体内试验探讨Chy-I对肝纤维化大鼠肝组织病理、TGF-β1/Smad通路的影响。方法 体外实验：取HSC-T6细胞，分为对照组、模型组（TGF-β1）和Chy-I大、中、小剂量组，检测Chy-I对HSC的增殖抑制率，并采用PCR法和蛋白印迹法检测TGF-β1、I型胶原和α-SMA等基因及蛋白的表达。体内试验： 肝纤维化组和Chy-I治疗组采用四氯化碳造模， Chy-I治疗组在造模同时给予Chy-I灌胃治疗。造模第56天取肝脏组织，采用HE染色、免疫组化染色等观察肝脏组织病理， qPCR检测肝脏TGF-β1、Smad3、Smad7及AngII等肝纤维化指标mRNA表达；蛋白质印迹法检测肝脏TGF-β1、Smad3、Smad7及肝纤维化指标的蛋白表达。 结果 体外实验 ①Chy-I可抑制HSC增殖及表达TGF-β1等肝纤维化相关因子的表达；体内试验 ②Chy-I明显改善肝脏组织病理; ③模型组肝组织TGFβ1、Smad3、AngⅡ及各项纤维化指标mRNA表达增多（P<0.05/），Smad7表达减少（P<0.01）; Chy-I组上述指标较模型组明显改善；④蛋白印迹法检测模型组肝脏TGF-β1、Smad3、肝纤维化指标明显升高（P<0.05）, Smad7蛋白表达明显下降（P<0.01）。与模型组比较Chy-I组TGF-β1、smad3蛋白表达下降且有显著差异（P<0.05），Smad7蛋白明显升高（P<0.05）。结论 Chy-I可能通过多位点调控TGF-β1/Smad通路来改善肝纤维化。