Ca2+及钙依赖型蛋白激酶在拟南芥气孔发育过程中的作用

气孔的形成、分布及密度除了受自身发育进程调节外，还受到外界环境因素如水分、二氧化碳、光照等的影响。钙依赖型蛋白激酶（CDPK）作为一类重要的钙感受器，既能感受钙信号，又能通过磷酸化下游底物进行信号传递响应植物生长发育和环境胁迫过程。已有数据显示钙信号参与了气孔发育过程，关于CDPK在气孔发育方面的研究尚未有报道。本项目小组前期已获得了拟南芥CDPK基因家族全部的GUS转基因株系，并筛选到几个在气孔中较特异表达且响应干旱胁迫的CDPK基因。本项目将利用细胞生物学、分子生物学、分子遗传学等理论与方法，研究钙离子及CDPK基因在气孔发育过程中的作用，以及它们与已知气孔发育调控基因的相互关系。通过此项研究，将初步阐明钙离子及CDPK在干旱胁迫下调控气孔发育的作用，为通过表皮气孔发育的功能调控来提高作物的水分利用和碳同化提供一定的理论依据。

钙在植物生长发育及响应逆境胁迫信号过程中具有重要作用。在不同刺激诱导不同的钙信号的产生，能够被不同的钙感受器感受，并传递给下游，导致蛋白磷酸化和基因表达模式的改变。高等植物中目前已知的钙感受器主要包括CaM及CML, CBL和CDPKs。目前关于钙感受器是否参与气孔发育及逆境胁迫的研究并不够深入，本项目完成了以下研究内容：（1）药理学实验研究Ca2+信号是否参与气孔发育。分别用钙螯合剂（EGTA）、钙通道抑制剂（LaCl3）、钙调素抑制剂（TFP、W7）对拟南芥幼苗进行处理，高浓度对植物有害，,低浓度的EGTA和LaCl3会引起气孔密度的降低, 30ºC高温和TFP处理同时处理拟南芥幼苗会产生“气孔簇”的表型。（2）拟南芥CDPKs基因表达分析。从获得的34个CDPKs的promoter:GUS材料进行染色分析，我们发现有6个基因在气孔发育过程中也有表达。这些GUS染色结果，为研究CDPK在气孔发育过程中的作用提供了重要信息。（3）拟南芥CDPKs、CaMs、CMLs基因突变体的获得和气孔表型观察。初步研究结果表明，这些单个基因的突变体的气孔分布格局与野生型比，并无明显的差异，这可能是由于存在基因之间的功能冗余引起。（4）气孔发育特异时期表达CDPK的表型观察。根据pCDPK:GUS的染色结果，我们分别构建了pSPCH:CDPK、pMUTE:CDPK、pFAMA:CDPK材料，通过在气孔的发育的特定时期过表达CDPK，观察其对气孔发育的影响。在pFAMA:CPK5中，气孔在发育过程中发生多次分裂，产生了“毛毛虫”状的气孔表型，推测CPK5参与影响细胞周期过程。（5）CDPKs参与干旱和可能下游基因参与逆境胁迫的研究。除已报道的CDPK参与逆境胁迫过程外，我们的研究发现其它CDPKs还参与逆境胁迫过程。对CDPK可能调控的下游基因进行分析，细胞周期蛋白激酶CDKB1不仅参与了气孔发育，而且参与响应逆境胁迫过程。cdkb1;1 1;2双突变体表现为对盐和干旱耐受。cdkb1;1 1;2参与干旱胁迫反应与其气孔密度相关，cdkb1;1 1;2参与盐胁迫反应与微管骨架的稳定性相关。通过以上的研究，我们初步了解了CDPK在气孔发育过程中的作用，并对其可能调控的下游基因在参与逆境胁迫过程进行了研究，为通过调控气孔发育过程提高植物对逆境胁迫的适应提供了一定的理论依据。