中药芫花中Reg3A抑制剂的发现、结构修饰及构效关系研究

Colorectal cancer (CRC) is a kind of malignant disease, which threatens to human health heavily, chemotherapy and targeted therapy drugs have side effects and drug resistance in different degree. It is necessary to speed up the development of new colorectal cancer drugs. The development of Reg3A inhibitors is a new research direction in the treatment of CRC and other related cancer drugs. Chinese herbal medicine is important resource for drug development, our previous study found that the daphnane diterpenoids were isolated from Chinese herbal Daphne genkwa, which can significantly inhibit the high expression of Reg3A cell lines LOVO and RKO. Nine compounds exhibited strains of high expression cell lines stronger activity than the positive control, 5-fluorouracil, in which compound 16 represented the most active compound with inhibition rate of 72.5% and 83.5%, respectively. In the course of our ongoing project, we will continue to isolate and identify a series of daphnane diterpenoids from the flower buds of Daphne genkwa, and to carry out structure modification to obtain diverse compounds. Herein, the structure isolate and identify, screening of inhibiting Reg3A activity, and structure-activity relationship of these compounds are described. Reg3A overexpression cell model and in vivo animal activity test were used to screen high efficiency and low toxicity Reg3A inhibitors. This project will lay a solid foundation for Reg3A inhibitors with independent intellectual property rights.

结直肠癌(CRC)是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤疾病，化疗药物和靶向治疗药物等都存在不同程度的毒副作用。加快研发新型的结直肠癌药物已刻不容缓。Reg3A抑制剂的研发是目前治疗CRC等相关癌症药物的新方向，在前期研究中我们发现中药芫花(Daphne genkwa)中的瑞香烷型二萜类成分具有显著抑制Reg3A高表达人结肠癌细胞株LOVO和RKO，其中9个化合物对两株高表达的细胞株抑制活性均强于阳性对照5-氟尿嘧啶，化合物16对两株细胞的抑制率分别达到(72.5%和83.5%)。本项目拟在此基础上对芫花进行系统化学成分和抑制Reg3A活性研究，并对含量丰富的活性成分进行结构修饰，构建更多瑞香烷型二萜类化合物，筛选抑制Reg3A活性，探讨构效关系，利用Reg3A过表达细胞模型和动物体内活性测试等方法筛选出高效低毒的 Reg3A抑制剂候选化合物，为研究具有自主知识产权的Reg3A抑制剂提供基础。

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤疾病，经实验证实，有效抑制Reg3A，能明显减缓结直肠癌症状，可以作为药物治疗结直肠癌的新靶点。天然产物是重要的药物开发资源，我们前期发现传统中药芫花Daphne genkwa 的石油醚部位能明显抑制Reg3A高表达的人结肠癌细胞株的活性。我们对芫花中的石油醚部位进行系统分离和结构鉴定，从中发现一系列的瑞香烷二萜共22个，其中新化合物7个（1-7），我们通过波谱手段和计算ECD，分离鉴定了49个单体化合物，并确定了新化合物1-7的绝对构型。并对量丰二萜进行结构修饰，共获得25个新的人工衍生物。用MTT法对天然的22个瑞香烷型化合物进行抗肿瘤（SW620、LoVo、和RKO）活性初筛，结果显示化合物1、12、13和19对Reg3A高表达的三种肿瘤细胞均有抑制作用，IC50范围为2.96-24.5 μM之间，其中化合物1抑制SW620细胞生长的IC50为2.96 μM，有明显的抗肿瘤活性。对化合物1诱导结肠癌细胞SW620凋亡的机制进行研究。结果表明给药组随药物浓度增加，细胞膜皱缩破裂，核染色质固缩呈圆珠状并被染为红色，出现凋亡小体。Annexin V-FITC/PI染色后流式检测凋亡比例，在1/4 IC50浓度时凋亡细胞数量增加，随着药物浓度增加，凋亡细胞比例也在上升，在4倍于IC50浓度时达到了97%。Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，结果显示抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax表达增加，下游Cleaved caspase-9，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-PARP表达增加，化合物1可能是通过线粒体凋亡通路诱导SW620细胞凋亡。另外对化合物1抑制结肠癌细胞SW620增殖的作用机制进行研究。采用流式细胞仪检测细胞PI染色结果，不同浓度给药组与空白组相比，细胞有丝分裂阻滞在G0/G1期。通过Western blot检测药物作用下PI3K/Akt/mTOR通路标志性的蛋白表达的变化，结果显示p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达下调，表明化合物1能抑制PI3K/Akt/mTOR通路重要蛋白磷酸化，起到抗增殖作用。因此化合物1有可能成为Reg3A抑制剂的候选药物分子，用于治疗结直肠癌。