两个与杨树花药发育相关的R2R3-MYB基因的功能研究

目前，对于花药发育分子机理的研究主要局限于拟南芥、烟草、矮牵牛等草本植物，而在林木花药发育分子机理的研究方面积累的资料甚少。杨树是重要的经济树种，由于其基因组较小，且具有完善的遗传转化体系，已成为研究林木遗传、发育及基因工程改良的模式植物。本实验室首次从杨树花药中分离到2个R2R3-MYB类基因PeMYBF1和PeMYBF2，并分别对它们的表达模式进行了初步分析。在此基础上，本申请将分别对PeMYBF1和PeMYBF2的表达调控及其生物学功能进行深入探讨。具体包括：分析PeMYBF1和PeMYBF2基因的表达及调控机制；确定PeMYBF1和PeMYBF2蛋白是否为转录因子；利用反向遗传学技术（过量表达和抑制表达）鉴定PeMYBF1和PeMYBF2基因的生物学功能。本项目的完成将为深入理解花药及花粉的分子机理提供重要资料。同时，为通过遗传工程控制杨树育性奠定基础。

目前，对于花药发育分子机理的研究主要局限于拟南芥、烟草、矮牵牛等草本植物，而在林木花药发育分子机理的研究方面积累的资料甚少。本实验室首次从林木模式植物−杨树花药中分离到的2个R2R3-MYB基因PeMYBF1和PeMYBF2，本项目围绕这两个基因的表达及功能进行探讨。具体包括：（1）利用实时定量RT-PCR方法分别对它们的表达模式进行分析，结果显示，PeMYBF1在根、茎、叶等营养器官中不表达，而在雌花序及雄花序中特异表达，并且在不同发育时期的雄花序中其表达水平受到严格控制； PeMYBF2主要集中在雄花序中表达，在茎中仅微弱表达。（2）分别将PeMYBF1和PeMYBF2基因与报告基因GFP融合，通过在洋葱表皮细胞的瞬时表达确定PeMYBF1和PeMYBF2定位在细胞核中，进一步借助酵母系统确定PeMYBF1和PeMYBF2均有转录激活活性，从而证实PeMYBF1和PeMYBF2为转录激活因子。（3）分别构建PeMYBF1和PeMYBF2过量表达载体，转化拟南芥。通过对转基因拟南芥表型分析，发现过量表达PeMYBF1的转基因植株均表现为不同程度的果荚结实率减少，进一步分析结果显示，该表型是由花药败育引起的。利用RT-PCR技术分析转基因植株中苯丙酸代谢途径中重要基因如PAL、C4H、4CL3、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等表达水平的变化，结果显示，与野生型相比，转基因植株中PAL、ANS和 C4H的表达水平显著升高，而CHS 和DFR表达水平下降，说明PeMYBF1过量表达表达引起了拟南芥中苯丙酸代谢的改变。（4）进而，构建PeMYBF1和PeMYBF2的RNAi表达载体，转化杨树，现已得到转基因植株；（5）从杨树花药中分离到了另外2个R2R3-MYB基因PeMYBF3和PeMYBF4，并对其表达模式及编码蛋白的亚细胞定位进行了分析。本项目的完成将为深入理解花药及花粉发育的分子机理提供重要资料。同时，为通过遗传工程控制杨树育性奠定基础。